Differential Scanning Calorimetry &#8212; A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen

Ibrahim B. Durowoju; Kamaljit S. Bhandal; Jian Hu; Bruce Carpick; Marina Kirkitadze

doi:10.3791/55262

JoVE Journal > Biochemistry

Biochemistry

Calorimetria exploratória diferencial - um método para avaliar a estabilidade térmica e Conformação do Antigen Protein

Published: March 04, 2017

doi:

10.3791/55262

Ibrahim B. Durowoju¹, Kamaljit S. Bhandal¹, Jian Hu¹, Bruce Carpick¹, Marina Kirkitadze¹

¹Analytical Research & Development,Sanofi Pasteur Limited

Summary

Calorimetria de varrimento diferencial mede a temperatura de transição térmica (S) e energia de calor total necessário para desnaturar uma proteína. Os resultados obtidos são usados para avaliar a estabilidade térmica dos antigénios de proteínas em formulações de vacinas.

Abstract

calorimetria de varrimento diferencial (DSC) é uma técnica analítica que mede a capacidade de calor molar de amostras em função da temperatura. No caso de amostras de proteína, perfis de DSC fornecer informações sobre a estabilidade térmica, e, em certa medida serve como uma "impressão digital" estrutural que pode ser utilizada para avaliar a conformação estrutural. É realizada utilizando um calorímetro de varrimento diferencial, que mede a temperatura de transição térmica (temperatura de fusão; T _m) e a energia necessária para romper as interacções de estabilização da estrutura terciária (entalpia; AH) de proteínas. As comparações são feitas entre as formulações, bem como lotes de produção, e as diferenças de valores derivados indicam diferenças na estabilidade térmica e conformação estrutural. Dados que ilustram o uso de DSC em um ambiente industrial para estudos de estabilidade, bem como de monitoramento principais etapas de fabricação são fornecidos como prova da eficácia deste proprotocolo. Em comparação com outros métodos para avaliar a estabilidade térmica de conformações de proteínas, DSC é custo-efetiva, requer alguns passos de preparação de amostras, e também fornece um perfil termodinâmico completo do processo de desdobramento da proteína.

Introduction

Calorimetria de varrimento diferencial (DSC) é um método experimental que mede directamente a diferença na absorção de energia de calor ter lugar numa amostra em relação a uma referência durante uma mudança de temperatura regulada ^{^1,} ^{^2,} ^{^3,} ^{^4,} ^{^5,} ^{^6,} ^{^7,} ^{^8,} ⁹ ^, ^{^10,} ^{^11,} ^12. Realizada num calorímetro de varrimento diferencial, o método envolve a introdução de energia térmica para uma célula de amostra e uma célula de referência simultaneamente ao aumentar de forma idêntica a temperatura de ambas as células ao longo do tempo ^{^2,} ^{^13,}14. Devido à diferença na composição da amostra e a referência, diferente quantidade de energia será necessária para elevar a temperatura das células ^{^2,} ^{^12,} ^13. Assim, o excesso de quantidade de energia necessária para compensar a diferença de temperatura entre as células é medida e directamente correlacionada com propriedades termodinâmicas específicas da amostra ^{^1,} ^3.

Na década de 1960, MJ O'Neil e E. Watson da Perkin Elmer desenvolveu o primeiro calorimetria exploratória diferencial para medir o fluxo de calor de materiais sólidos ^{^2,} ^{^3,} ^4. Em paralelo, PL Privalov e DR Monaseldze EL do Instituto de Física, República da Geórgia (ex-URSS) criou um calorímetro adiabático diferencial exclusivo que pode ser usado for pesquisas bioquímicas ^{^5,} ^6. Posteriormente, a equipe de Andronikashvili no Instituto de Física, República da Geórgia, informou a capacidade de calor de biomoléculas, como proteínas fibrosas e globulares, DNA e RNA usando DSC ^{^7,} ^{^8,} ^9. Várias equipes lideradas por Sturtevant ^{^10,} ^{^11,} ^12, Brandts ¹³ e Privalov ^{^14,} ^{^15,} ¹⁶ com foco no desenvolvimento da teoria e aplicações práticas de DSC para investigar os detalhes termodinâmicas de proteína se desdobrar. O valor de DSC no estudo de grandes estruturas supramoleculares, tais como fagos, cloroplastos, cristais líquidos, de fosfolípidos e as proteínas da carne, também têm sido relatados ¹⁷ </ ^sup>, ^{^18,} ^{^19,} ^20.

DSC tornou-se comum em pesquisa e desenvolvimento farmacêutico para a avaliação da estabilidade térmica de biomoléculas, em especial proteínas ^{^1,} ^{^21,} ^22. Isto é principalmente devido aos avanços em termos de sensibilidade e automação da instrumentação utilizado para realizar a experiência ^{^23,} ^24. Aqui, o resultado final da experiência DSC, ou seja, a capacidade de calor molar como uma função da temperatura, é utilizado para estimar os seguintes parâmetros termodinâmicos (alteração na capacidade calorífica (ΔCp), entalpia (AH), a entropia (Ds) , e a energia livre de Gibbs (ΔG)) utilizando a equação abaixo:

eq1.jpg "/> (1)

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(5)

Onde Cp é medida a capacidade de calor; q é o fluxo de calor para dentro do material de teste; T ₀ e t são as temperaturas iniciais e finais da ^transição, respectivamente, ^{^22,} ^25. Também é interessante notar que as equações acima aplicam-se a proteínas de domínio único que podem sofrer de transição de dois Estados e reversível térmica desdobramento ^22. Análise de proteínas mais complexas (proteínas, por exemplo, não-dois-estatais, e oligômeros) have foi relatado por Friere et ai. ^26; Johnson et ai. ^27; e Kasimova et ai. ^28.

Para determinar se uma proteína sofre transição de dois estados ou formas intermediários durante a desnaturação térmica, a entalpia calculado experimentalmente (AH; também referida como entalpia calorimétrico _Cal AH) é comparada com a entalpia derivada usando a equação de van't Hoff dada abaixo (também referido como van't Hoff entalpia; AH _VH):

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Onde T _m é a temperatura de ponto médio da transição, R é a constante dos gases perfeitos (1,987 cal mol ^-1 ^K-1) e Y é a fracção da população de proteínas no estado desdobrado, ^{^16,} ^29. E seAH _VH é igual a AH _Cal; ou AH _VH / AH _Cal é igual a 1, então a proteína sofre um "tudo-ou-nada" transição (ou seja, de dois estados de transição) ^{^16,} ^{^25,} ^29. No entanto, se AH _VH é menor do que AH _Cal; ou _VH AHV / AHV _Cal é inferior a 1, a proteína sofre uma transição não-dois-estado ^{^16,} ^{^25,} ^29. A proporção de AH _VH / AH _Cal também corresponde à proporção da estrutura da proteína que derrete como uma unidade cooperativa termodinâmico ou domínio ^26.

Os parâmetros termodinâmicos mencionados acima, como ΔG e AHV fornecer informações úteis sobre a estabilidade térmica de proteínas, incluindo produtos biológicos ^30. No entanto, a ênfase será colocada em T _m e AHV nesta publicação, pois eles são os valores reportados para este protocolo. _Tm é a temperatura do ponto médio da transição, em que o dobradas e desdobradas os estados da proteína estão no estado de equilíbrio (isto é, ΔG = 0) ^{^25,} ^31. Quanto maior a _Tm de uma proteína, maior será a sua estabilidade térmica ^31. AH corresponde à área sob o pico (s) de a capacidade de calor contra um gráfico de temperatura (também conhecido como termograma) gerado no final da experiência DSC ^{^16,} ^25. Ele é a energia necessária para desnaturar as proteínas e pode ser utilizado para estimar a fracção activa _(FA) em uma formulação de proteína (isto é, a proporção de proteínas com a conformação activa numa amostra), usando a seguinte equação:

jove_content ">

(7)

Onde AHV é a entalpia experimentalmente derivado da amostra de proteína e Q é a entalpia determinado para uma referência bem caracterizada de proteínas ou padronizado ^22. A estimativa de F é _uma significativa para o controlo da estabilidade em tempo real dos produtos, bem como a realização de estudos de estabilidade sob condições de stress, conforme exigido pelas directrizes da ICH ^32. Comparação de AH também fornece informações sobre a compacidade da estrutura de conformação terciária de uma proteína de ^31.

Este protocolo detalhes um procedimento para a avaliação da estabilidade térmica de proteínas em um ambiente industrial e tem sido extensivamente utilizada para a formulação de vacinas. Foi desenvolvido utilizando um calorímetro diferencial de varrimento automatizado que gera resultados reprodutíveis fou concentrações de proteína tão baixas quanto 300 ug / mL.

Protocol

1. Instrumento Start-up Ligue o calorímetro diferencial de varrimento e aumentar a pressão nas células para suprimir a ebulição das amostras, bem como evitar a formação de bolhas a temperaturas elevadas. Isto é tipicamente conseguido através do fornecimento de azoto no sistema. Dependendo do material constituinte da célula (por exemplo, tântalo, ouro, platina, etc), ajustar a pressão do fornecimento de gás de azoto de acordo com a pressão recomendada pelo fabricante para evitar danificar a célula. Por exemplo, ajustar a pressão do fornecimento de gás de azoto a 45 psi para o instrumento usado para desenvolver este procedimento, e a pressão acima de 80 psi pode danificar a célula. Assegurar que todos os reservatórios do agente de limpeza são preenchidos com o volume requerido. Os agentes de limpeza necessários incluem detergente e água para lavar e limpar a célula, respectivamente, após cada amostra prazo. Regule a temperatura do compartimento de amostra segurandoa um valor adequado, de preferência 5 ° C, para manter a integridade da amostra antes da experiência. Preparação 2. Amostra Dializar a amostra contra o tampão que vai ser utilizado como a referência para o experimento. Alternativamente, o tampão de eluição recolhido no passo final de purificação de proteínas (isto é, a eluição da coluna) pode ser usado. Determinar a concentração da amostra de proteína utilizando o método de determinação da concentração de proteína mais adequado, tal como o método de Kjedahl 33 ou 34 método de Lowry. Para efeito de comparação objetiva dos resultados, usar o mesmo método de forma consistente dentro do mesmo estudo. O intervalo de concentração necessário pode variar dependendo do modelo do instrumento. Para o instrumento utilizado neste protocolo, a faixa de trabalho preferível é 0,5-1 mg / mL. Degas o tampão de amostra e referência no vácuo para se livrar de microbolhas que podem causar inaccur volume deACY. Esta etapa pode ser ignorada para os modelos mais recentes calorímetro. Usando uma micropipeta e pontas estéreis numa câmara de fluxo laminar biocontenção, carregar as amostras e o seu respectivo buffer em pares em placas de 96 poços compatíveis com o instrumento. Encher os dois primeiros pares de cavidades com o tampão e os dois últimos pares com água para o buffer de tampão e a verificação de água, respectivamente. Scans tampão-tampão verificar a adequação do instrumento antes da amostra de medição (ou seja, avaliação de erro de instrumentação), bem como estabelecer uma linha de base; enquanto scans de água são dirigidos para limpar as células. Cobrir a placa de 96 poços com uma película de selagem, e assegurar que os poços estão devidamente seladas antes de tomar a placa para fora do gabinete de biossegurança para evitar a contaminação da amostra. Coloque a placa no compartimento segurando amostra na orientação apropriada. Setup 3. Experimental Parâmetro Nota: Dependendo do instrumentation, as amostras podem ser carregadas para dentro da célula, quer manualmente, utilizando uma seringa, ou automaticamente utilizando um amostrador automático. Neste caso (ou seja, um ambiente industrial), um amostrador automático é usado para economizar tempo. Usando o software de aquisição, insira a informação da amostra na ordem a placa foi carregado conforme a secção 2.4. Digite concentrações se disponível, caso contrário, digite os valores de concentração em software de análise antes da análise de dados (secção 4.2). Selecione a opção que garante uma limpeza de células com detergente antes de cada digitalização do teste, que deve ser seguido por várias etapas de lavagem com água para garantir que nenhum resíduo de detergente é deixado nas células. Ajustar a temperatura de início da experiência a 20 ° C, mas isto pode variar, dependendo do conhecimento prévio da amostra. Para proteínas conhecidas, temperatura inicial pré-determinada pode ser utilizada, enquanto que uma temperatura inicial mais baixa pode ser aplicado a amostras desconhecidas. Defina a temperatura finalda experiência, por exemplo, 100 ° C. A temperatura final pode variar de acordo com o conhecimento prévio da amostra. Definir a taxa de varredura do experimento, por exemplo, 60 ° C / h, que é a taxa de varredura típica. No entanto, velocidade de varrimento pode variar dependendo do conhecimento prévio da amostra, por exemplo, 90 ° C / h, ou de 120 ° C / h. É aconselhável fazer a varredura amostras desconhecidas em diferentes taxas de varredura para avaliar a cinética de desdobramento. amostras Redigitalizar para investigar a reversibilidade da térmica desdobramento. O desdobramento de uma proteína é considerada reversível se a entalpia obtido pela segunda verificação é, pelo menos, 80% do valor de entalpia para o primeiro varrimento. Regule o termostato de pós-experimento para 10 ° C para preservar a integridade das células do calorímetro. Verifique se os parâmetros de configuração da experiência estão corretos antes de executar o experimento. Se tudo estiver no lugar, iniciar o experimento. 4. Dados AnANÁLISE Recuperar os dados em bruto a partir da experiência e seleccionar uma amostra de cada vez para a análise. Verificação de subtração de referência, ou seja, buffer, a partir da digitalização do teste. NOTA: subtração de referência é realizada automaticamente por modelos mais recentes de aparelhos DSC. Introduzir o valor da concentração da amostra se ele foi omitido conforme a secção 3.1. Fit e subtrair linha de base a partir da thermogram adquirida para explicar as diferenças nas capacidades de calor dos estados dobrada e desdobrada da proteína que é causada pela exposição de grupos hidrofóbicos de água sobre desdobramento. Linear ou cúbica curva de ajuste pode ser aplicada, dependendo da forma do perfil de DSC para a amostra. Por razões de consistência, o mesmo tipo de montagem tem de ser utilizado durante um estudo, por exemplo, estudos de estabilidade em tempo real. Esta etapa é necessária para processar a curva para o pico de integração para obter entalpia de transição. Realizar a integração de pico usando não-linear ajuste de mínimos quadrados. Com base em produtosconhecimento aplicar de dois Estados ou modelo não-dois-estado. modelo de dois-state pode ser usada para transições térmicas cooperativas individuais, e de proteínas desconhecidas, aplicar modelo não-dois estados até novo conhecimento sobre o produto está disponível. Se for o caso, ajuste ajuste de curva utilizando a curva de função encaixe iterativo de software do equipamento até que o valor do qui-quadrado permanece constante. Os resultados obtidos mostram que os valores para o ponto médio da temperatura de transição (Tm), calorimétrico entalpia (AH), e van't Hoff entalpia (AH VH) da amostra.

Representative Results

Os dados em bruto a partir de a maioria das experiências DSC são apresentados como um gráfico de fluxo de calor em relação a temperatura, como o calorímetro mede realmente a diferença na taxa de fluxo de calor para a solução da amostra e o tampão 35. Portanto, se ambas as células (ou seja, amostra e referência células) contêm soluções idênticas durante um experimento, os dados brutos da verificação deve ser uma linha reta sem picos observáveis. Qualquer pico observada pode ser atribuída a um erro de instrumentos (por exemplo, danificada ou contaminada células), que é por isso que a executar verificações tampão antes da amostra a analisar é um ensaio de adequabilidade do sistema adequado. A figura 1 ilustra o resultado de uma varredura típica tampão indicando que o calorímetro foi em boa condição de trabalho antes da amostra de análise. A Figura 2 mostra os dados em bruto para uma experiência DSC realizada na difflotes erent de duas amostras de proteínas. Como implicado anteriormente, os picos observados são as diferenças no fluxo de calor das amostras e os seus respectivos buffers. As diferenças na concentração da amostra pode causar variações na capacidade de calor registrados pelo calorímetro; no entanto, essas variações são normalizados durante a análise de amostras de acordo com o ponto 4.2 do procedimento. Concentrações mais elevadas podem também revelam os domínios termodinâmicas adicionais que não contribuem para a transição em concentrações mais baixas. Além disso, cada transição representa um domínio termodinâmico que pode incluir um ou mais domínios estruturais da proteína 36. Neste caso, a proteína 1 tem três domínios estruturais que derretem cooperativamente. A Figura 3 mostra os resultados obtidos a partir da análise dos dados em bruto para a proteína 1 e 2 apresentados na Figura 2, isto é, após a subtracção da linha de base e iterativo curva Fitting. Os termogramas resultantes foram normalizados para digitalizar taxa (automaticamente efectuada através de um algoritmo pré-determinado, no software de análise) e concentração; assim, apresentar os resultados da experiência na capacidade de calor comparável contra gráficos de temperatura. O software de análise utiliza dados de a capacidade de calor contra gráficos de temperatura, tais como T m e ΔCp, para derivar outros parâmetros termodinâmicos usando variações das equações dadas acima, dependendo da cooperatividade de proteína desdobramento. Ao testar amostras desconhecidas, definindo o intervalo de temperatura apropriada é crucial. Caso contrário, termogramas incompleta pode resultar, como ilustrado na Figura 4. Embora o t m a partir de tais perfis podem ser derivados, AH não pode ser determinado com precisão. Portanto, a amostra deve ser testada novamente com uma gama maior de temperatura para capturar totalmente a transição térmica. Algumas proteínas também reforma adily agrega após desnaturação completa, resultando em uma capacidade de calor de pós-transição aumentar: isso muitas vezes aparece como um termograma incompleta, tal como ilustrado na figura 2B. No entanto, repetição do teste com uma temperatura final mais elevado pode ajudar a confirmar se existe uma ocorrência de uma transição conformacional em que a região do termograma ou é meramente o efeito de absorção de calor de agregados de proteína. A estabilidade térmica é uma das propriedades físicas mais importantes de proteínas e produtos à base de proteínas na indústria 37. Na indústria farmacêutica, que é utilizada para determinar a estabilidade de produtos biológicos sob diferentes condições, incluindo tampões de formulação e de factores ambientais, tais como humidade e temperatura. É também utilizado para monitorizar o passo chave de fabrico (por exemplo, purificação e desintoxicação) para assegurar a consistência entre lotes de produção conformacional. <strong > As Figuras 5 e 6 ilustram a utilização da DSC para examinar os efeitos das condições de armazenamento e de desintoxicação química, respectivamente, sobre a estabilidade e a conformação estrutural de duas proteínas diferentes. As diferenças significativas na Tm e AHV indicam mudanças de conformação e degradação de proteínas, respectivamente. Além disso, a perda da terceira transição na Figura 6 ilustra ainda mais a degradação de um domínio que foi confirmado por uma diminuição no peso molecular, quando as amostras foram analisadas usando cromatografia de exclusão de tamanho com multi-ângulo de dispersão da luz (SEC-MALS) ( dados não mostrados). Figura 1: tampão Scans. A semelhança no gradiente de cada varredura sem picos observáveis indica que o instrumento está em boa condição de trabalho e gerou resultados reproduzíveis.//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55262/55262fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: dados brutos recolhidos a partir de experimentos DSC. Estes gráficos são boas representações dos dados não analisados (matérias) adquiridas após ensaios experimentais (ou seja, antes da subtracção da linha de base e ajuste de curva). Cada linha representa um lote de produção. Proteína 2 tende a agregar mais facilmente sob aquecimento, resultando num aumento da capacidade de aquecimento acima de 100 ° C na região de pós-transição do termograma. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. <br/> Figura 3: Dados Analisados DSC. Estes gráficos são boas representações de dados DSC analisados (isto é, após subtracção da linha de base e ajuste de curva). A linha azul representa o termograma após subtracção da linha de base, enquanto a linha vermelha representa a curva com o melhor ajuste para o termograma. (A) A T m e AH para a proteína 1 Amostra # 12 são 80,16 ° C e 1,69 x 10 6 cal / mol, respectivamente. (B) A T m e AH para a proteína 1 Amostra # 13 são 80,15 ° C e 1,71 x 10 6 cal / mol, respectivamente. (C) A T m e AH para a proteína 2 Amostra # 21 são 75,01 ° C e 4,08 x 10 6 cal / mol, respectivamente. (D) A T m e AH para Protein 2 Amostra # 22 são 75,67 ° C e 4,22 x 10 6 cal / mol, respectivamente. Por favor clique aqui paraver uma versão maior desta figura. Figura 4: Um Thermogram incompleta. Os dados brutos recolher para a proteína 1 analisada em uma faixa de temperatura inadequada. A temperatura final da experiência foi definido como 90 ° C, que não acomodar todo o perfil de transição da proteína em comparação com a experiência da Figura 2A, que foi ajustado para 120 ° C. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 5: analisados os dados que mostram o efeito de desintoxicação química sobre a estrutura terciária da proteína 1. (A) uma proteína é uma toxina na sua conformação nativa e HAs t a m a 56,84 ° C e AH em 2,57 x 10 5 kcal / mol. (B) A forma desintoxicada de proteína 1 (ou seja, toxóide) tem T m e valores ÔH de 81,01 ° C e 1,89 x 10 6 cal / mol, respectivamente. Assim, pode concluir-se que o passo de desintoxicação introduzida de alguma forma de variação para a conformação estrutural da proteína que confere uma maior estabilidade (superior T m) para a sua forma desintoxicada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 6: analisaram dados mostrando o efeito das condições de armazenamento sobre a conformação da proteína 3. Estes gráficos ilustram o efeito da temperatura de armazenamento (2 – 8 ° C) na estabilidade e estrutura terciária da ProTein 3 mais de 30 semanas. O T ÔH valores para a proteína 3 no dia 8 (A) e 38ª semana (B) de armazenagem e m são dadas na Tabela 1 abaixo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Amostra Tm 1 (° C) AH 1 (cal / mol) Tm 2 (° C) AH 2 (cal / mol) Tm 3 (° C) AH 3 (cal / mol) Proteína 3 armazenado a 2-8 ° C durante 8 semanas 61,91 1,71 x 10 5 75,54 2,17 x 10 5 90,29 4,17 x 10 5 <td> Protein 3 armazenado a 2-8 ° C durante 38 semanas 61,87 1,66 x 10 5 75.18 1,46 x 10 5 90.22 5,76 x 10 5 Tabela 1: Tm e ÔH Valores para Protein 3 na 8ª e 38ª semana de armazenamento a 2 – 8 ° C. Embora os valores de T m em ambos os pontos de tempo são semelhantes, a diferença nos valores ÔH indica que a estrutura terciária da proteína 3 tem degradado ao longo de 30 semanas sob as condições de armazenamento especificadas.

Discussion

Este procedimento tem sido incorporado com sucesso em vários pacotes de teste de caracterização, incluindo estabilidade e de comparabilidade produto estudos ^21. Em estudos de estabilidade em tempo real, DSC é usada para monitorizar a t _m, bem como _uma estimativa do F de biológicos ao longo do tempo para determinar o seu período de vida. No que diz respeito a comparabilidade do produto, que é utilizada para avaliar o impacto do processo e instalação de mudança bem como o efeito de passos de fabrico chave na conformação estrutural dos lotes produzidos. Isto tipicamente envolve a comparação directa do AH de lote produzido a um produto de referência que tenha sido designado como o produto ideal. Além disso, DSC provou ser uma ferramenta analítica muito útil para estudos de formulação do produto ^37. A T _m de uma proteína em diferentes tampões e em diferentes concentrações pode ser utilizado para determinar a formulação que profere a mais estabilidade dea proteína.

Para assegurar a confiabilidade desse método e objectividade dos seus resultados, é importante para manter os parâmetros de teste consistente de corrida a corrida dentro do mesmo estudo (por exemplo, vacina do estudo formulação). No entanto, o procedimento pode ser modificado para acomodar as diferenças nas propriedades físicas das várias proteínas. Um exemplo de uma modificação que pode ser feita está a alterar a velocidade de varrimento da experiência ^{^38,} ^39. As proteínas que eram propensos a agregados que formam quando aquecidos foram examinados a uma velocidade de exploração mais rápida (por exemplo, 120 ° C / h) para evitar a contribuição de agregados ao perfil de transição térmica além de entupimento dos vasos capilares do calorímetro. Vale a pena notar que a digitalização de taxa pode influenciar o resultado de uma experiência DSC ^38. Ampliação do pico de transição térmica tem sido observado com o aumento das taxas de digitalização em alguns proteínas; no entanto, T _m permaneceu constante ^38. Além disso, os passos de diálise e de desgaseif i cação para a preparação da amostra são também muito importante para obter resultados precisos ^31. A diálise assegura que a única diferença na composição da amostra e o tampão é a proteína; Assim, todo o excesso de calor absorvido pela amostra pode ser atribuído à capacidade de calor da proteína. Desgaseificação garante análise volume preciso, como a extrapolação do parâmetro termodinâmico assume que o evento desdobramento está ocorrendo sob pressão e volume ³¹ constante. A porção de pressão constante do pressuposto é contabilizado por pressurização de azoto do sistema de acordo com o ponto 1.1 do processo.

Em comparação com outros métodos de determinação da estabilidade das conformações de proteínas, tais como Dicroísmo Circular (CD) e de fluorescência de espectroscopias, DSC oferece um número de vantagens em um COMconfiguração comercial incluindo economias de custo e tempo. Em primeiro lugar, o desenho adiabática de um calorímetro de varrimento diferencial permite a medição da estabilidade térmica com melhor precisão da temperatura, em comparação com as medições com instrumentação para CD e fluorescência de espectroscopias ^6. Em segundo lugar, ao contrário do CD, a precisão dos dados de DSC não está dependente da configuração helicoidal da proteína ^{^39,} ^40; no entanto, CD fornece informações adicionais sobre o desdobramento da estrutura secundária, que seria complementar ao DSC ^41. Além disso, a pressurização do sistema DSC permite o teste com uma vasta gama de temperaturas, sem ferver a amostra; Assim, uma ampla gama de proteínas pode ser testado por DSC.

Enquanto DSC é uma abordagem relativamente rápido e simples para determinar a estabilidade térmica dos produtos biológicos, não é sem limitações. Em primeiro lugar, a base depasso linha de subtração apresenta algum tipo de inconsistência humana na análise de dados brutos; Assim, variações nos resultados pode ser observada entre diferentes usuários. Em segundo lugar, calorímetro diferencial de varredura têm limites mínimos de concentração que podem ser difíceis de atingir a escala de produção em massa. Em terceiro lugar, o AH da desnaturação térmica irreversível não é absoluta; o que implica que ΔG derivado (um indicador de estabilidade da proteína) em cenários similares pode ser enganadora. Além disso, o método funciona melhor para amostras purificadas. A presença de impurezas pode ou causar uma mudança na _Tm, se houver uma interacção com a proteína sob investigação, ou o aparecimento de novas transições térmicas, se não houver interacção. Em qualquer caso, esses recursos extras nos termogramas pode ser erroneamente atribuída a amostras, afetando, assim, a interpretação dos resultados. Apesar destas limitações, DSC continua a ser um método confiável que pode fornecer informações detalhadas sobre termodinâmica the proteína processo de desdobramento, se implementada corretamente ^42.

Em conclusão, a DSC oferece vantagem considerável como ferramenta de leitura conformacional para produtos vacinais e seus intermediários. Os dois parâmetros, T _m e AH, recolhidas por uma matriz de lotes de um mesmo produto podem tornar-se uma linha de base empírica de que pode ser usado para examinar o impacto das alterações de processo, formulação e condições de armazenamento sobre a estrutura terciária e a estabilidade da proteína e antígenos virais ^{^21,} ^43.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores são muito gratos a José Mancini (anteriormente com a GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments limitada) pelo seu papel na instalação e treinamento sobre a calorimetria diferencial de varredura, Sasmit Deshmukh e Webster Magcalas para as discussões.

Materials

Differential Scanning Calorimeter	Malvern Instruments Ltd	28428948 (Via GE Healthcare)	Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors.
Contrad 100	Decon Laboratories Inc	1504	Dilute with water to 20% before use
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate	Canadian Life Science	ML072100	Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used
MicroCal ThermoVac	Malvern Instruments Ltd	N/Ap	provided with the Cap VP DSC
Biosafety cabinet	Labconco	Logic+ – A2	biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation
Slide-A-Lyzer dialysis cassette	Thermo Scientific	66810 or 66380	to equilibrate the sample and buffer

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Durowoju, I. B., Bhandal, K. S., Hu, J., Carpick, B., Kirkitadze, M. Differential Scanning Calorimetry — A Method for Assessing the Thermal Stability and Conformation of Protein Antigen. J. Vis. Exp. (121), e55262, doi:10.3791/55262 (2017).

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