Diferansiyel tarama kalorimetrisi, bir proteinin denatüre edilmesi gerekli ısı geçiş sıcaklığına (ler) ve toplam ısı enerjisini ölçer. elde edilen sonuçlar, aşı formülasyonlarında protein antijenlerinin termal stabilitesini değerlendirmek için kullanılır.
Diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC), sıcaklığın bir fonksiyonu olarak numunelerin molar ısı kapasitesini ölçer analitik bir tekniktir. Protein örnekleri durumunda, DSC profilleri termal stabilitesi hakkında bilgi ve bir ölçüde yapısal konformasyonunun değerlendirmek için kullanılabilen bir yapısal "parmak izi" olarak işlev görür. (T m erime sıcaklığı) ve üçüncül yapısını stabilize etkileşimleri bozmak için gerekli olan enerji (entalpi, AH) proteinlerin Termal geçiş sıcaklığını ölçen bir diferansiyel tarama kalorimetresi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Karşılaştırmalar formülasyonlar yanı sıra üretim partiler arasında yapılır ve elde edilen değerleri arasındaki farklar termal stabilite ve yapısal konformasyonunda farklılık gösterir. Stabilite çalışmaları için bir endüstriyel ortamda DSC kullanımını gösteren yanı sıra önemli üretim aşamalarının izlenmesi Veriler bu pro etkinliği kanıtı olarak sunulmaktadırtokol. protein şeklindeki termal stabilitesini değerlendirmek için, diğer yöntemlere göre, DSC ve düşük maliyetli olan birkaç örnek hazırlama adımlarını gerektirir ve aynı zamanda protein açılma işleminin tam bir termodinamik bir profil sağlar.
Diferansiyel tarama kalorimetrisi (DSC) ile doğrudan düzenlenmiş bir sıcaklık değişimi, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 sırasında bir referans bir numunenin yer alan ısı enerjisi emme farkını ölçer deneysel bir yöntemdir , 10, 11, 12. Bir diferansiyel tarama kalorimetresi Yürütülen yöntem, örnek bir hücre ve aynı zamanda 2, 13 üzerine her iki hücre sıcaklığının artırılması, aynı anda da, bir referans hücresi içine ısı enerjisi sokulması içerir14. , Numune ve referans bileşim içinde fark, farklı enerji miktarı hücreleri, 2, 12, 13 sıcaklığını yükseltmek için gerekli olacaktır. Bu durumda, hücreler arasındaki sıcaklık farkı telafi etmek için gerekli olan enerji, fazla miktarı ölçülür ve doğrudan örnek 1, 3 özel termodinamik özellikleri ile bağıntılandınlabilir.
1960'larda, MJ O'Neil ve Perkin Elmer E. Watson katı maddelerin, 2, 3, 4, ısı akışını ölçmek için, ilk diferansiyel tarama kalorimetre geliştirdi. Buna paralel olarak, PL Privalov ve Fizik Enstitüsü, DR Monaseldze EL Gürcistan Cumhuriyeti (eski SSCB) fo kullanılabilecek eşsiz bir diferansiyel adyabatik kalorimetre yarattır biyokimyasal araştırmalar 5, 6. Daha sonra, Gürcistan Fizik Enstitüsü, Cumhuriyet de Andronikashvili ekibi, bu tür DSC 7, 8, 9 kullanarak lifli ve küresel proteinler, DNA ve RNA gibi biyomoleküllerin ısı kapasitesi bildirdi. Sturtevant 10, 11, 12, Brandts 13 ve Privalov 14, 15, 16 liderliğindeki birkaç takım protein açılımı termodinamik detaylarını araştırmak için teori ve DSC pratik uygulamaların geliştirilmesi üzerinde duruldu. Bu fajlar, kloroplast, fosfolipid, sıvı kristaller, ve et proteinler gibi büyük supramoleküler yapıları okuyan DSC değeri de 17 bildirilmiştir </ sup>, 18, 19, 20.
DSC şimdi, biyomoleküllerin ısıl kararlılık değerlendirilmesi için özellikle proteinler 1, 21, 22 ilaç araştırma ve geliştirme alanında olağan hale gelmiştir. Bu deney 23, 24 yürütmek için kullanılan aletlerin duyarlılığı ve otomasyon bakımından gelişmeler çoğunlukla kaynaklanmaktadır. Burada, DSC deney, sıcaklığın bir fonksiyonu olarak, yani molar ısı kapasitesi nihai sonucu, aşağıdaki termodinamik parametreleri tahmin etmek için kullanılır (ısı kapasitesi (ΔCp), entalpi (AH), entropi değişim (ΔS) denklemi aşağıda kullanarak ve Gibbs serbest enerjisi (ΔG)):
eq1.jpg "/> (1)
(2)
(3)
(4)
(5)
Nerede Cp ısı kapasitesi ölçülür; q test materyalinin içine ısı akışı olduğu; T 0 ve T, sırasıyla 22, 25 geçiş ilk ve son sıcaklık dereceleridir. Bu denklemler yukarıda iki devletli geçişi ve termal tersinir 22 açılımı tabi olabilir tek alan proteinler için de geçerli olduğunu fazlalaştı. Daha karmaşık proteinler (örneğin, olmayan iki devletli protein ve oligomerler) Analizi hFriere ve arkadaşları tarafından rapor edilmiştir ave. 26; Johnson ve diğ. 27; ve Kasimova ve diğ. 28.
Bir protein, iki durum geçişini maruz veya termal denatürasyon sırasında ara maddeleri oluşturur olup olmadığını belirlemek için, deneysel olarak elde edilen entalpi (AH; ayrıca şu şekilde kalorimetrik entalpi Sh Cal adlandırılır), aynı zamanda (aşağıda verilen van't Hoff denklemi kullanılarak elde edilen entalpi karşılaştırılır van't Hoff entalpi olarak anılacaktır; Sh VH):
(6)
Tm geçişin orta noktasını sıcaklığı, R, ideal gaz sabiti (1.987 kal mol-1 K-1) ve Y, katlanmamış durumda 16, 29 protein nüfusun bölümüdür. EğerSh VH Sh Cal eşittir; veya Sh VH / Sh Cal 1'e eşit olduğu, daha sonra protein bir "ya hep ya hiç" geçiş (yani iki devletli geçiş) 16, 25, 29 uğrar. Ancak, Sh VH Sh Cal az ise; veya Sh VH / Sh Cal protein olmayan bir iki devletli geçişi 16, 25, 29 uğrar, daha az 1'dir. Sh VH / Sh Cal oranı da bir termodinamik kooperatif birimi veya etki alanı 26 olarak erir protein yapısında oranına tekabül etmektedir.
ΔG ve Sh gibi yukarıda sözü edilen termodinamik parametreler biyolojik içeren proteinlerin termal stabilitesi hakkında yararlı bilgiler sağlar 30. Bu protokol için bildirilen değerler Ancak, vurgu, bu yayındaki T m ve Sh üzerine döşenecek. Tm katlanmış protein kıvrımlanmamış dengede olan geçiş, (örneğin, ΔG = 0) 25, 31 orta noktası sıcaklığıdır. Termal stabilite 31 daha yüksek bir proteinin Tm kadar yüksek olur. Sh (aynı zamanda termogramı olarak da bilinir) sıcaklık grafiğidir ısı kapasitesi tepe (ler) altında kalan alan karşılık gelen DSC deneyi 16, 25 bir ucunda oluşturulan. Bu proteinleri denatüre etmek için ve bir protein formülasyondaki aktif fraksiyonu (F) tahmin etmek için de kullanılabilir gerekli enerji (yani, bir numunedeki aktif yapının proteinlerin oranı), aşağıdaki denklem kullanılarak:
jove_content "> (7)Burada Sh protein örneğinin deneysel olarak türetilmiş entalpi ve Q da iyi karakterize edilmiş referans veya standart protein 22 için belirlenen entalpisini. F a tahmini ICH 32 uyarınca stres koşullarında stabilite çalışmaları ürünlerin gerçek zamanlı istikrarı izleme yanı sıra yürütülmesi için önemlidir. Sh karşılaştırılması da bir protein 31 üçüncül yapı konformasyon kompakt hakkında bilgi sağlar.
Bu protokol, bir sanayi ortamında protein termal stabilitesini değerlendirmek için bir yöntem detayları ve yoğun aşı formülasyonunda kullanılmıştır. Tekrarlanabilir sonuçlar f üreten bir otomatik diferansiyel tarama kalorimetresi kullanılarak geliştirilmiştirya da 300 ug / mL gibi düşük bir protein konsantreleri.
Bu prosedür başarıyla istikrar ve ürün karşılaştırma çalışmaları 21 dahil olmak üzere çeşitli karakterizasyon testi paketleri, dahil edilmiştir. Gerçek zamanlı stabilite çalışmalarda, DSC, raf ömrünü belirlemek için Tm'ye izlemek, hem de zaman içinde biyolojik F, bir tahmin etmek için kullanılır. Ürün karşılaştırılabilirlik açısından, süreç ve tesis değişikliğinin etkilerini yanı sıra üretilen birçok yapısal konformasyon anahtar üretim aşamalarının etkisini değerlendirmek için kullanılır. Bu genellikle ideal bir ürün olarak tayin edilmiştir referans ürüne üretilen partisinin Sh doğrudan karşılaştırılmasını gerektirir. Buna ek olarak, DSC ürün formülasyon çalışmaları 37 için yararlı bir analitik araç olduğunu kanıtlamıştır. Farklı tamponlar ve farklı konsantrasyonlarda bir proteinin Tm en kararlılık proffers formülasyonu tespit etmek için kullanılabilirProtein.
Bu yöntem ve sonuçlarının objektifliği güvenilirliğini sağlamak için, aynı çalışmada (örneğin, aşı formülasyonu çalışması) içinde çalıştırmak için çalışma tutarlı test parametrelerini tutmak önemlidir. Bununla birlikte, işlem çeşitli proteinlerin fiziksel özelliklerde farklılık uyum için değiştirilebilir. Yapılabilir bir modifikasyon örneği deney 38, 39 tarama hızını değiştirmektedir. Daha hızlı bir tarama oranında incelenmiştir ısıtıldığında oluşturucu agrega eğilimli olan proteinler (örneğin, 120 ° C / saat) kalorimetre kılcal tıkanma gibi termik geçiş profilinin agrega katkı önlemek için. Bu oran tarayarak bir DSC deney 38 sonucunu etkileyebilir dikkati çekiyor. Termal geçiş zirve genişletilmesi yanlısı bazı tarama oranlarının artırılması ile gözlenmiştirproteinlerinin; Ancak, Tm oldukça sabit 38 kalmıştır. Ayrıca, numune hazırlama için diyaliz ve gaz giderme adımları da doğru sonuçlar 31 için çok önemlidir. Diyaliz örnek ve tampon kompozisyonu tek fark protein sağlar; Bu şekilde, numune tarafından emilen tüm aşırı ısı proteinin ısı kapasitesi ile de ilişkilendirilebilir. Termodinamik parametre ekstrapolasyon açılımı olay sabit hacim ve basınç 31 altında oluştuğunu varsayar olarak gaz alma, hassas ses analizini sağlar. varsayım sabit basınç kısmı prosedürünün bölüm 1.1 uyarınca sisteme azot basınçlandırma ile muhasebeleştirilir.
Bu dairesel dikroizm (CD) Floresans Spektroskopileri olarak protein şeklindeki stabilitesini belirlemek için diğer yöntemler ile karşılaştırıldığında, DSC bir COM bir dizi avantaj sunarmaliyet ve zaman tasarrufu da dahil olmak üzere mercial ayarı. CD ve Floresans Spektroskopileri 6 enstrümantasyon ile ölçümlere göre Birincisi, bir diferansiyel taramalı kalorimetre adyabatik tasarımı daha iyi sıcaklık hassasiyetle termal stabilite ölçümü için izin verir. İkinci olarak, CD farklı olarak, DSC verilerin doğruluğu protein 39, 40 arasında helisite bağlı değildir; Ancak, CD DSC 41 ücretsiz olacağını ikincil yapının açılımı hakkında ek bilgi sağlar. Buna ek olarak, DSC sistemin basınç örnek kaynatmadan geniş bir sıcaklık aralığı test sağlar; Bu yüzden, proteinlere geniş bir DSC ile test edilebilir.
DSC biyolojik termal stabilitesini belirlemek için, nispeten hızlı ve basit bir yaklaşım olsa da, sınırlama olmadan değildir. İlk olarak, noktahat çıkarma adımı ham veri analizi, insan tutarsızlık çeşit tanıttı; Böylece sonuçlar farklılıklar, farklı kullanıcılar arasında gözlemlenebilir. İkinci olarak, diferansiyel tarama kalorimetreleri toplu üretim ölçeğinde elde etmek zor olabilir asgari konsantrasyon sınırları var. geri dönüşümsüz termal denatürasyon Üçüncüsü, Sh mutlak değildir; ki içindeki senaryolarda türetilmiş ΔG (protein kararlılığının bir göstergesi) yanıltıcı anlamına gelmektedir. Bundan başka, yöntem, saflaştınlmış numuneler için yararlıdır. Herhangi bir etkileşim olup olmadığını İnceleme proteini veya yeni bir termal geçişler görünümü ile bir etkileşim olup olmadığını yabancı maddelerin varlığı Tm bir değişikliğe neden olabilir ya da. Her durumda termogramları, bu ek özellikler yanlış böylece sonuçların yorumlanmasını etki, örnekler atfedilebilir. Bu kısıtlamalara rağmen, DSC th hakkında detaylı termodinamik bilgi verebilir güvenilir bir yöntem olmaya devamDüzgün 42 uygulanması halinde süreci açılımı e proteini.
Sonuç olarak, DSC aşı ürünler ve ara ürün için bir yapısal okuma aracı olarak önemli bir avantaj sunuyor. Aynı ürünün çok bir dizi için toplanan iki parametre, Tm ve Sh, proses değişiklikleri, formülasyon, ve tersiyer yapının depolama koşulları ve protein stabilitesi etkisini incelemek için kullanılabilir ampirik taban çizgisi olabilir ve viral antijenler 21, 43.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar tartışmalar için diferansiyel taramalı kalorimetre, Sasmit Deshmukh ve Webster Magcalas kurulum ve eğitim rollerinden ötürü (eski GE Healthcare ile), Joseph Mancini, Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments sınırlı) için müteşekkiriz.
Differential Scanning Calorimeter | Malvern Instruments Ltd | 28428948 (Via GE Healthcare) | Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors. |
Contrad 100 | Decon Laboratories Inc | 1504 | Dilute with water to 20% before use |
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate | Canadian Life Science | ML072100 | Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used |
MicroCal ThermoVac | Malvern Instruments Ltd | N/Ap | provided with the Cap VP DSC |
Biosafety cabinet | Labconco | Logic+ – A2 | biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation |
Slide-A-Lyzer dialysis cassette | Thermo Scientific | 66810 or 66380 | to equilibrate the sample and buffer |