Estimulação da sinalização Notch no mouse osteoclastos Precursores

A via de sinalização Notch de mamífero é homóloga da mesma via em Drosophila melanogaster e consiste de quatro receptores transmembrana entalhe (Notch1-4) e cinco ligandos ligados à membrana do entalhado (JAG1 & JAG2) e semelhante a delta (DLL1, 3, & 4) famílias ^1. Sinalização Notch é iniciado quando o receptor Notch em uma célula receptora é obrigado pelo ligando em uma célula de transmissão ^2. Durante este trans-activação, o ligando ligado à membrana Notch produz uma força de estiramento sobre o receptor de Notch ligada a membrana ^{3, 4.} A força de estiramento do ligando de ligação induz alterações conformacionais no receptor de Notch que facilitam a clivagem extracelular do receptor por TNFalfa enzima de conversão (TACE), seguido por um evento de clivagem intracelular mediada por um complexo de gama-secretase (γ-secretase) contendo presenilina. γ-secretase libera o int Notchdomínio racellular (NICD), que transloca para o núcleo, onde forma um complexo de activação da transcrição com CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), idealizador-like (MAML), e fatores específicos do tipo de célula para conduzir a expressão de alvejar genes ^5.

Os elementos mecânicos de resultado de activação de sinalização Notch na necessidade de métodos exclusivos da activação da via de Notch in vitro. Notch ligandos solúveis podem ligar-se a receptores de Notch, mas não conseguem produzir forças de estiramento necessárias para a libertação de NICD enquanto ao mesmo tempo inibir competitivamente a ligação de ligandos de entalhe associada a células. Assim, a adição de ligantes Notch solúvel para o meio de cultura pode atenuar Notch normal de sinalização ^{6, 7.} Felizmente, os ligandos de Notch pode induzir a libertação de NICD se eles são fixados a um substrato apropriadamente rígida ^{5, 8, 9,10.} Sementeira em células de cultura de substratos revestidos com ligando ou a aplicação de contas revestidas com ligando às células pode tanto activar a sinalização de Notch, e a escolha entre elas depende primeiramente do tempo desejado de estimulação de Notch. Para a activação de sinalização de Notch imediato e temporário, tal como seria desejado durante o ponto médio de um ensaio funcional ou diferenciação, ligando de Notch pode ser ligado a esferas de agarose, aplicados a células de cultura, e lavou-se a qualquer momento. Para mais sinalização Notch sustentada a partir do início de um período de cultura, placas de cultura de tecidos podem ser revestidos com ligando antes da sementeira celular.

Para os efeitos do presente protocolo, os métodos são realizados utilizando precursores de osteoclastos de rato, mas os métodos e variações sobre os métodos aqui descritos são aplicáveis a uma ampla variedade de tipos de células ^{6, 11, 12, 13,} </sup> ^14. Os osteoclastos são células terminalmente diferenciadas que linage hematopoiéticos são responsáveis pela reabsorção de tecido ósseo, e eles estão implicados em vários distúrbios de perda de osso ^15. Assim, no estudo in vitro da diferenciação de osteoclastos a partir dos seus precursores de monócitos / macrófagos de linhagem e os mecanismos moleculares que controlam a sua função é essencial para uma melhor compreensão dos osteoclastos e desenvolvimento de novas terapias de regeneração de osso. Enquanto ele é agora geralmente aceite que a sinalização Notch desempenha um papel positivo na diferenciação e função dos osteoclastos, as variações tanto da estimulação sinalização Notch e osteoclastos cultura precursor e diferenciação conduziu a resultados contraditórios inicialmente ^{16, 17, 18, 19.} Um exame mais detalhado das diferenças de métodos e utilização de genéticamodelos têm muito esclarecido o papel da sinalização Notch na osteoclastogênese, mas a aplicação de métodos de estimulação Notch e cultura padronizados poderia evitar tais controvérsias em estudos futuros de sinalização Notch em outros tipos de células ^{20, 21, 22, 23.}

Existem vários métodos para a cultura de precursores e de diferenciação de osteoclastos de rato, e, como com os métodos diferentes para estimular a sinalização de Notch, o melhor método irá depender da questão experimental. Aqui, será apresentado o nosso método preferido de cultura frações aderentes e não aderentes de células de medula liberadas a partir de ossos longos de rato. Este método tem a vantagem de exigir essencialmente nenhum equipamento especializado e a produção de células que são aplicáveis ​​a uma variedade de métodos de diferenciação.