Stimulation de Notch Signalisation dans Souris ostéoclastes Précurseurs
Summary
Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.
Abstract
Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.
Introduction
La voie de signalisation Notch mammifère est homologue à la même voie dans Drosophila melanogaster et se compose de quatre récepteurs transmembranaire de Notch (Notch1-4) et cinq ligands liés à la membrane du Jagged (JAG1 & JAG2) et Delta-like (DLL1, 3, & 4) familles 1. Signalisation Notch est déclenchée lorsque le récepteur Notch dans une cellule réceptrice est liée par un ligand sur une cellule de transmission 2. Au cours de cette trans-activation, le ligand Notch lié à la membrane produit une force d' étirement sur le récepteur Notch liée à la membrane 3, 4. La force d'étirement de la liaison du ligand induit des changements de conformation dans le récepteur Notch qui facilitent le clivage extracellulaire du récepteur de TNF-alpha enzyme de conversion (TACE), suivie d'un événement de clivage intracellulaire médiée par une gamma sécrétase complexe (γ-sécrétase) contenant préséniline. γ-secrétase libère l'int Notchdomaine racellular (NICD) qui translocation dans le noyau où il forme un complexe d'activation transcriptionnelle avec CBF-1-Su (H) -Lag-1 (CSL), Mastermind-like (GAML), et les facteurs spécifiques de type cellulaire pour conduire l'expression de cibler des gènes 5.
Les éléments mécaniques du résultat de l' activation de signalisation Notch dans le besoin de procédés uniques d'activation de la voie Notch in vitro. ligands de Notch solubles peuvent se lier à Notch récepteurs, mais ne parviennent pas à produire des forces d'étirement nécessaires à la libération NICD tout en même temps inhibition compétitive de liaison des ligands de Notch associés aux cellules. Ainsi, l' addition de ligands de Notch solubles dans le milieu de culture peut atténuer Notch normale de signalisation 6, 7. Heureusement, les ligands de Notch peuvent induire une libération NICD si elles sont fixées à un substrat rigide approprié 5, 8, 9,10. Ensemencer des cellules sur des substrats de culture revêtues de ligand ou de l'application des billes de ligand revêtu à des cellules peut aussi activer la signalisation Notch, et le choix entre les deux dépend essentiellement du temps désiré de stimulation de l'entaille. Pour une activation immédiate, temporaire signalisation Notch, comme cela serait souhaité au cours du point médian d'une analyse fonctionnelle ou de la différenciation, le ligand de Notch peut être lié à des billes d'agarose, appliqué à des cellules en culture, et on le lave à tout moment. Pour en savoir plus soutenue signalisation Notch à partir du début d'une période de culture, des plaques de culture tissulaire peuvent être enrobés avec le ligand avant l'ensemencement des cellules.
Aux fins du présent protocole, des procédés sont réalisés en utilisant des précurseurs d'ostéoclastes de souris, mais les méthodes et variations des procédés décrits ici sont applicables à une grande variété de types de cellules 6, 11, 12, 13, </sup> 14. Les ostéoclastes sont des cellules terminalement différenciées lignage hématopoiétiques qui sont responsables de la résorption du tissu osseux, et ils sont impliqués dans de multiples troubles de la perte osseuse 15. Ainsi, dans l' étude in vitro de la différenciation des ostéoclastes à partir de leurs précurseurs monocytes / macrophages-lignage et les mécanismes moléculaires contrôlant leur fonction est essentielle à une meilleure compréhension des ostéoclastes et le développement de nouvelles thérapies osseuses régénérant. Alors qu'il est maintenant généralement admis que la signalisation Notch joue un rôle positif dans la différenciation et la fonction des ostéoclastes, les variations dans les deux Notch signalisation stimulation et ostéoclastes culture précurseur et la différenciation ont conduit à des résultats contradictoires initialement 16, 17, 18, 19. Un examen plus approfondi des différences dans les méthodes et l'utilisation des ressources génétiquesmodèles ont grandement clarifié le rôle de la signalisation Notch dans ostéoclastogenèse, mais l' application des méthodes de stimulation et de culture Notch standardisés pourraient empêcher de telles controverses dans les études futures de signalisation Notch dans d' autres types de cellules 20, 21, 22, 23.
Il existe plusieurs méthodes pour la culture et la différenciation des précurseurs d'ostéoclastes de souris, et, comme avec les diverses méthodes de stimulation de la signalisation Notch, la meilleure méthode dépendra de la question d'expérimentation. Ici, notre méthode préférée de la culture de fractions adhérentes et non-adhérentes de cellules de la moelle rincés à partir des os longs de souris sera présenté. Cette méthode présente l'avantage de ne nécessiter pratiquement pas d'équipement spécialisé et pour produire des cellules qui sont applicables à une variété de procédés de différenciation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes critiques au sein du protocole
Culture et dans la différenciation in vitro de précurseurs d'ostéoclastes fournit une plate – forme utile pour l' étude des mécanismes moléculaires de l' ostéoclastogenèse et l' identification de cibles thérapeutiques pour la régénération osseuse et la préservation de la masse osseuse. Lorsque la culture de précurseurs d'ostéoclastes de souris, l'élément le plus critique est l'entretien des…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), a grant from the AO Foundation (S-16-12A), the Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center, and an intramural orthopaedic surgery departmental research development fund. JWA is supported by the University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) fellowship funded by the National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).
Materials
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
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