تحفيز اشارة الشق في ماوس تآكل العظام Osteoclast السلائف
Summary
Notch signaling is a form of cellular communication that relies upon direct contact between cells. To properly induce Notch signaling in vitro, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state. This protocol describes methods for in vitro stimulation of Notch signaling in mouse osteoclast precursors.
Abstract
Notch signaling is a key component of multiple physiological and pathological processes. The nature of Notch signaling, however, makes in vitro investigation of its varying and sometimes contradictory roles a challenge. As a component of direct cell-cell communication with both receptors and ligands bound to the plasma membrane, Notch signaling cannot be activated in vitro by simple addition of ligands to culture media, as is possible with many other signaling pathways. Instead, Notch ligands must be presented to cells in an immobilized state.
Variations in methods of Notch signaling activation can lead to different outcomes in cultured cells. In osteoclast precursors, in particular, differences in methods of Notch stimulation and osteoclast precursor culture and differentiation have led to disagreement over whether Notch signaling is a positive or negative regulator of osteoclast differentiation. While closer comparisons of osteoclast differentiation under different Notch stimulation conditions in vitro and genetic models have largely resolved the controversy regarding Notch signaling and osteoclasts, standardized methods of continuous and temporary stimulation of Notch signaling in cultured cells could prevent such discrepancies in the future.
This protocol describes two methods for stimulating Notch signaling specifically in cultured mouse osteoclast precursors, though these methods should be applicable to any adherent cell type with minor adjustments. The first method produces continuous stimulation of Notch signaling and involves immobilizing Notch ligand to a tissue culture surface prior to the seeding of cells. The second, which uses Notch ligand bound to agarose beads allows for temporary stimulation of Notch signaling in cells that are already adhered to a culture surface. This protocol also includes methods for detecting Notch activation in osteoclast precursors as well as representative transcriptional markers of Notch signaling activation.
Introduction
والثدييات الشق يشير المسار هو مثلي إلى نفس المسار في ذبابة الفاكهة، ويتكون من أربعة مستقبلات الغشاء الشق (Notch1-4) وخمسة بروابط بغشاء من خشنة (JAG1 وJAG2) ودلتا مثل (DLL1، 3، & 4) أسر 1. يبدأ الشق الإشارات عندما يرتبط مستقبلات درجة على خلية المستقبلة التي يجند على خلية يحيل 2. خلال هذا التنشيط عبر والشق يجند بغشاء ينتج قوة تمتد على بغشاء الشق مستقبلات 3 و 4. القوة تمتد من يجند ملزم يؤدي الى تغييرات بتكوين في مستقبلات الشق التي تسهل انشقاق خارج الخلية من المستقبلات التي كتبها TNFalpha تحويل انزيم (TACE)، يليه حدث انشقاق داخل الخلايا بوساطة التي تحتوي على presenilin جاما secretase معقدة (γ-secretase). النشرات γ-secretase كثافة العمليات الشقنطاق racellular حوال التي translocates داخل النواة حيث يشكل مجمع تفعيل النسخي مع البرازيلي-1-سو (H) -Lag-1 (CSL)، العقل المدبر مثل (MAML)، وخلية العوامل نوع معين لدفع التعبير استهداف الجينات 5.
العناصر الميكانيكية الشق يشير نتيجة التنشيط في الحاجة إلى أساليب فريدة من تفعيل الشق المسار في المختبر. يمكن بروابط الشق القابلة للذوبان ربط الشق المستقبلات، لكنه يفشل في إنتاج تمتد القوات اللازمة للافراج حوال وفي الوقت نفسه تثبيط تنافسية ملزمة بروابط الشق المرتبط الخلية. وهكذا، إضافة بروابط الشق القابلة للذوبان في ثقافة المتوسط يمكن أن تخفف الشق الطبيعي يشير 6 و 7. لحسن الحظ، يمكن بروابط الشق لحث على الإفراج حوال إذا كانت ثابتة على ركيزة صلبة مناسبة 5، 8، 9،10. بذر الخلايا على ركائز الثقافة المغلفة يجند أو تطبيق حبات المغلفة يجند إلى الخلايا على حد سواء يمكن تفعيل الشق الإشارات، والاختيار بينها يعتمد في المقام الأول على توقيت المطلوب من التحفيز الشق. لتفعيل الشق يشير فوري، مؤقت، كما هو المطلوب خلال منتصف فحص وظيفي أو التمايز، يجند الشق يمكن أن تكون ملزمة لالاغاروز الخرز، وتطبيقها على الخلايا المستزرعة، وجرفت في أي وقت. لمزيد من الإشارات الشق متواصلة من بداية الفترة الثقافة، لوحات زراعة الأنسجة يمكن أن تكون مغلفة مع يجند قبل البذر الخلية.
لأغراض هذا البروتوكول، ويتم تنفيذ طرق من استخدام السلائف الماوس ناقضة العظم، ولكن الأساليب والاختلافات على الطرق الموضحة هنا تنطبق على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا 6، 11، 12، 13، </سوب> 14. الآكلة هي عضال متباينة الخلايا المكونة للدم عدد الأسطر التي هي المسؤولة عن ارتشاف النسيج العظمي، وكانوا متورطين في الاضطرابات متعددة من فقدان العظام (15). وهكذا، الدراسة في المختبر من تمايز الخلايا الآكلة من السلائف الوحيدات / بلعم-نسبهم والآليات الجزيئية التي تتحكم في وظيفتها هي ضرورية لفهم أفضل للالآكلة وتطوير علاجات جديدة لتجديد العظام. في حين اصبح من المقبول عموما أن يشير الشق تلعب دورا إيجابيا في التمايز وظيفة الخلايا الآكلة، والاختلافات في كل من التحفيز يشير الشق وناقضة العظم ثقافة السلائف والتمايز أدى إلى البداية النتائج المتناقضة 16، 17، 18، 19. دراسة أعمق للاختلافات في طرق واستخدام الوراثيةنماذج قد أوضح كثيرا من دور الإشارات الشق في osteoclastogenesis، ولكن تطبيق أساليب التحفيز الشق وثقافة موحدة يمكن منع مثل هذه الخلافات في الدراسات المستقبلية من الإشارات الشق في أنواع الخلايا الأخرى 20، 21، 22، 23.
وهناك طرق متعددة لزراعة والتفريق السلائف الماوس ناقضة العظم، وكما هو الحال مع طرق مختلفة لتحفيز الشق إشارة، فإن أفضل طريقة تعتمد على مسألة تجريبية. هنا، سيتم تقديم أسلوبنا المفضل للزراعة كسور ملتصقة وغير ملتصقة من خلايا نخاع العظام مسح من الماوس طويلة. هذا الأسلوب له ميزة تتطلب في الأساس ليست معدات متخصصة وإنتاج الخلايا التي تنطبق على مجموعة متنوعة من الطرق التقليدية.
Protocol
Representative Results
Discussion
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
ثقافة والتمايز المختبر السلائف ناقضة العظم توفر منبرا مفيدا للتحقيق في الآليات الجزيئية من osteoclastogenesis وتحديد الأهداف العلاجية لتجديد العظام والحفاظ على كتلة العظام. عندما زراعة السلائف الماوس ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the University of Pennsylvania Center for Musculoskeletal Disorders (5 P30 AR050950-09), a grant from the AO Foundation (S-16-12A), the Philadelphia VA Medical Center Translational Musculoskeletal Research Center, and an intramural orthopaedic surgery departmental research development fund. JWA is supported by the University of Pennsylvania Postdoctoral Opportunities in Research and Teaching (PENN-PORT) fellowship funded by the National Institute of General Medical Sciences Institutional Research and Career Development Award (IRACDA; 5 K12 GM081259-08).
Materials
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
References
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin. Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo. Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).
- Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies. Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).
- Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).
- Small, D., et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).
- Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers. Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).
- Varnum-Finney, B., et al. The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).
- Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).
- Yang, B., et al. Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts. Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).
- Urs, S., et al. Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model. Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).
- LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression. J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).
- Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it?. Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).
- Ma, J., et al. Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation. Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).
- Bai, S., et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells. J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).
- Yamada, T., et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells. Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).
- Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).
- Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), R45 (2012).
- Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
- Fukushima, H., et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis. Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).
- Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption. J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).
