כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה של חבל טבור האנושי (UC) ו מדגם שליה העובר לתוך חוט קרונית (CL), ג'ל וורטון (WJ), צומת חבל-שליה (CPJ), ואת השליה עוברת (FP) עבור הבידוד ואפיון של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) באמצעות טכניקת תרבות explant.
חבל הטבור האנושי (UC) ואת השליה אינם פולשניים, פרימיטיבי ומקורות שפע של תאי סטרומה mesenchymal (MSCs) צברו יותר ויותר תשומת לב כי הם אינם מהווים כל דאגות אתיות או מוסרית. שיטות קיימות כיום לבודד MSCs מ UC להניב כמויות נמוכות של תאים עם פוטנציאלי התפשטות משתנים. מאז UC הוא איבר אנטומי-מורכב, הבדלים במאפייני MSC יכולים להיות בגלל ההבדלים באזורי אנטומיים הבידוד שלהם. במחקר זה, אנו ראשונים גזורים דגימות כבל / שליה לשלושה אזורי אנטומיים דיסקרטיים: UC, צומת חבל-שליה (CPJ), ואת שליה עוברת (FP). שנית, שני אזורים מובחנים, רירי כבל (CL) ו ג'ל וורטון (WJ), הופרדו. טכניקת תרבות explant שמשה אז לבודד תאים מהארבעה המקורות. הזמן דרוש התרבות העיקרית של תאים מן explants מגוונת בהתאם למקור של הרקמה. תולדה של התאים התרחשה בתוך 3 – 4 daי"ש של explants CPJ, בעוד הצמיחה נצפתה לאחר 7 – 10 ימים ו -11 – 14 ימים מ CL / WJ ו explants FP, בהתאמה. התאים הבודדים היו חסיד הפלסטיק ומוצגים סמני מורפולוגיה פני fibroblastoid, כגון CD29, CD44, CD73, CD90, ו CD105, בדומה מח עצם (BM) MSCs -derived. עם זאת, את יעילות מושבת יוצרים של התאים המגוונים, עם CPJ-MSCs ו WJ-MSCs מראה יעילות גבוהה יותר מאשר BM-MSCs. MSCs מכל ארבעה מקורות הבדיל לתוך adipogenic, chondrogenic, שושלות לסרטן העצמות, המעיד על כך שהם היו מולטיפוטנטיים. CPJ-MSCs הבדיל באופן יעיל יותר בהשוואה למקורות אחרים MSC. תוצאות אלו מעידות כי CPJ הוא האזור אנטומיים החזק ביותר הניב מספר גבוה יותר של תאים, עם יכולות התחדשות עצמית התפשטות יותר במבחנה. לסיכום, הניתוח ההשוואתי של MSCs מהארבעה המקורות ציין כי CPJ הוא מקור מבטיח יותר של MSCs עבור טיפול בתא, regenerativרפואת e, והנדסת רקמות.
תאי גזע נמצאים איברים ורקמות שונים של הגוף. הם בעלי פוטנציאל התחדשות ולשחק תפקיד מרכזי בתיקון רקמות ניזוקו בגוף לאורך כל תוחלת החיים האנושיים 1, 2. זה יצר הרבה עניין תאי גזע בוגרים (ASCs), במיוחד מאז, בניגוד לתאי גזע עובריים (ESCs), השימוש ASCs אינו מהווה דילמות מוסריות ואתיות. מספר מחקרים דיווחו על הבידוד של ASCs, כגון תאי סטרומה mesenchymal (MSCs); תאי גזע hematopoietic (HSCs); ואת אבות שונים, לרבות מקורות שונים בוגרת החל מח עצם (BM) כדי רקמה שומנית (AT) ו שיני עיסה 3, 4, 5. עם זאת, מספר ASCs נוכחים ברוב הנישות המבוגרות מוגבל, והבידוד שלהם בדרך כלל כרוך הליך פולשני וכואב עם תורם אפשריתחלואת אתר. בנוסף, גיל תורם ולחץ סביבתי גם יכולים לשחק תפקיד משמעותי בקביעת איכות הפעילות ביולוגית של התאים המבודדים 6, 7, 8. ASCs גם להציג שגשוג מוגבל פוטנציאל התמיינות במהלך בתרבות חוץ גופית.
כדי להתגבר על חסרונות אלה של ASCs הנוכחי, מקורות חדשים כבר רדף לבודד תאי גזע. מאמצים אלה הובילו את הבידוד של תאי גזע ממקורות סביב לידה, כולל דם טבורים, רקמת חוט, שליה, ואת מי שפיר 9 נוזל. מקורות אלה זכו לתשומת לב בגלל הזמינות הקלה והשופעת שלהם 10, 11, 12, 13. יתר על כן, רקמות סביב לידה ניתן להשיג הלא פולשני, ותאי גזע המופקים מהןיותר פרימיטיבי ASCs מבודד ממקורות מבוגר 14, 15. הם מנותקים מן הרקמות השיגו בלידת נחשבים עברו שינויים מינימאליים בגנום בשל לחצי הזדקנות סביבתיים 16.
עם זאת, המאפיינים דיווחו של תאי גזע ממקורות סביב הלידה ואת הפוטנציאל שלהם עצמית לחדש וכן להבדיל להשתנות 11 נרחב, 17. זה יכול להיות בין השאר בשל העובדה כי חבל הטבור האנושי (UC) הוא איבר מורכב. אנו משערים כי אזורים נפרדים של רקמות סביב הלידה ליצור נישות ספציפיות אחראי וריאציות והטבע פרימיטיבית יותר של תאי גזע אלה בהשוואה ASCs ממקורות שאינם סביב הלידה. מחקר זה מתאר את דיסקציה של דגימות כבל / שליה לשלושה אזורי אנטומיים דיסקרטיים: UC, צומת חבל-שליה (CPJ), גידולהשליה העובר ד (FP). UC היה גזור נוסף לשני אזורים: רירית כבל (CL) ו ג'ל וורטון (WJ). ניתוח של תאים מבודדים מן CL, WJ, CPJ, ו FP הפגינו שכולם הציג מורפולוגיה fibroblastoid והביע סמנים MSC, אך הם נבדלו עצמית והתחדשות ופוטנציאל בידול שלהם. CPJ שמקורם בתאי הציג בשיעור גבוה יותר של הפוטנציאל התפשטות עצמית והתחדשות לעומת UC- ותאי FP-נגזר, מה שהופך אותם למקור מבטיח יותר עבור טיפול בתא, רפואה רגנרטיבית, והנדסת רקמות.
התקדמות במחקר תאי גזע לא רק שפרה את ההבנה של תהליכי פיתוח בסיסיים אלא גם ספקה הזדמנויות מבטיחות עבור השימוש בתאי גזע ב ביוטכנולוגיים, תרופות, טיפול בתא, רפואת רגנרטיבית, ויישומי הנדסת רקמות 18, 19, 20. בעוד ESCs פלוריפוטנטיים מבודדים מעוברים מוקדמים הם המבטיחים ביותר, הם מתמודדים עם אתגרים טכניים דילמות אתיות 21, 22, 23. תאי גזע מושרים (iPSCs) נגזרים תאי בוגרים לספק אלטרנטיבה, אבל גם הם מתמודדים עם בעיות טכניות ובטיחות דומות 23. יתר על כן, iPSCs לא יכול להיות גנטי יציב או אולי יש שינויים גנטיים שעברו, ובכך להגביל השימוש הטיפולי שלהם. תאי גזע גם דווחו במגוון TIS לאחר הלידההתובעת ואיברים. המקורות הנפוצים ביותר של ASCs ואלה מח עצם, שומן, רקמות השריר. עם זאת, ASCs ממקורות לידה מוגבל צמיחה ופוטנציאל בידול 24, 25. הם גם סובלים בשל הזדקנות וחשיפה ללחצים סביבתיים ובכך הם לא תמיד יעילים עבור יישומים רפואיים 26, 27, 28. זה הוביל אותנו ואחרים כדי לחפש מקורות חדשים של תאי גזע כי הם נאיביים יותר ASCs.
חקרנו מקורות סביב הלידה עבור תאי גזע פרימיטיבי כחלופה ASCs. בדו"ח זה, אנו מספקים שיטה אמינה, יציבה, ופשוט לבודד MSCs אדם מן דגימות כבל / שליה. לשם השוואה למקורות ושיטות אחרים המשמשים את הבידוד של ASCs, בשיטה זו מספקת שיטה יעילה ולא פולשנית לבידוד כמויות גדולות של בפוMSCs h-איכות. כמו כן מדגיש את פוטנציאל הצמיחה והתבדלות הגבוה של MSCs סביב הלידה לעומת MSCs ממקורות מבוגרים כגון BM.
UC מצרף העובר לשליה הוא איבר גדול עם אזורים אנטומיים ברורים, כולל שני העורקים, עורק, CL, ו WJ (הרקמה שמסביב כלי הדם). מספר מחקרים דיווחו על הבידוד של MSCs מחוט כולו, WJ, או השליה, עם צמיחה משתנה והבחנה הפוטנציאלים 25, 29. עם זאת, עד כה, אף מחקר לא נחקר באופן יעיל בהשוואה לתאים מאזורי אנטומיים שונים של מדגם כבל / שליה. אנו מספקים כאן שיטה שיטתית ופשוטה לנתיחה של UC, CPJ, ומחובר FP לבידוד של MSCs. אנחנו גם להראות פרוטוקול מקיף ופשוט לאפיין ולהעריך את איכות התאים מבודדים על ידי קביעת capabil שגשוגםities, כמו גם הפוטנציאלים התחדשות עצמית והבחנה שלהם. שיטה זו היא לשחזור מניב כמות גדולה של MSCs מעולה באיכות.
מצאנו כי העיכול החלקי של חתיכות רקמה 1-2 מ"מ גודל באמצעות פתרון טריפסין מסחרי תאי ניב reproducibly מן explants, ואילו העיכול המלא של רקמה לתוך תאים בודדים היו תשואות עניות של תאים בודדים. עם זאת, מחקר אחד דיווח כי explants רקמות גדולות יותר של UC כ 10 מ"מ בגודל היו אופטימליים תא הבידוד 30. לעומת זאת, במחקר אחר הציע את שיטת explant הרקמות הביאה מחזור תרבות ארוך בתשואה נמוכה של תאים לעומת שיטת עיכול האנזים 31. בדוחות קודמים, לטיפול כבל רקמות עם collagenase השנייה hyaluronidase, בנפרד או בעקבות טריפסין, בוצעו לבודד תאים בחוט 32, 33 <sup>, 34. לא רק שיש מידה רבה של וריאציה בשיטות עיכול של רקמת החוט לפני culturing, אלא גם התאים הבודדים שנראה הטרוגנית. שימוש אנזימים קשים עבור פרקי זמן ארוכים עלול לבזות את קרום התא, המשפיע תא דבקות ושגשוגם. התוצאות של שיטה זו הראתה כי explants רקמות סביב הלידה-מעוכל חלקית סיפק תולדה של תאים מבלי לגרום נזק לתאים נרחב, מתוחזק כדאיות, והניבה כמויות גבוהות יותר של אוכלוסיות הומוגניות של MSCs.
בעוד הפרוטוקול לנתיחה והבידוד של תאים מן explants הוא פשוט, חלק מהשלבים עלול להוכיח להיות מאתגר. ראשית, להבטיח עמידת explant בכך שהוא מאפשר את הקשר שלהם אל פני השטח של בקבוק התרבות. זה יכול להיות קל באמצעות כמות קטנה של מדיום, רק מכסה את חתיכות רקמה לתרבות 2 h של הראשון, ולאחר מכן מוסיף בקפדנות את המדיום הנותר. Second, להגביל את מספר explants פחות מ 15 לכל בקבוק T75. שטח קטן מדי בין החלקים או חתיכות רבות מדי לכל בקבוק הם מעכב עבור תולדת תא. חתיכות שלישיות, רקמות שאינם מקלה על פני השטח של בקבוק התרבות לאחר 3 ימים של דגירה תועברנה בבקבוק חדש עבור דבקות ו culturing. חתיכות רביעיות, רקמות כדי להיות מתורבתות צריך להיות חופשי של פסולת תא, אשר מעכבת מצורפת. החמישית, התרביות של חתיכות גדולות דורשות מדיום יותר ואינה לשפר יעילות תולדת תא. לבסוף, לפקח על תרבויות explant מקרוב, במיוחד לאחר הופעת תולדת תא, כמו התאים עשויים להפוך במהירות ומחוברות ולבדל בהתאם למקור הרקמה. כמה מגבלות של הטכניקה כוללים חוסר מומחיות לנתח דגימות להפריד בין CL, WJ, CPJ, ו FP; גודל מדגם קטן, וכתוצאה מכך תשואת WJ נמוכה; ו-עיבוד הדגימות מתעכבות נדרשות להיות מעובד תוך 2-4 שעות של אוסף כדי AVOid הפסד התאוששות התא.
תקן הזהב עבור האפיון של MSCs הוא היכולת לדבוק פלסטיק, מהווה את הפנוטיפ fibroblastic, להתמיין שושלות מרובות. אלה הם גם קריטריונים נפוצים בשימוש להגדרת MSCs כמתואר ע"י ISCT 35. במחקר זה, התאים מבודדים מכל ארבעת המקורות היו חסיד הפלסטיק והיה ביטוי חיובי עבור סמני MSC (CD29, CD44, CD73, CD90, ו CD105) אבל ביטוי שלילי של CD45 סמן hematopoietic. בנוסף, הם הביעו אנטיגן לויקוציטים אנושיים (HLA) אני בכיתה אבל היו שליליים לשיעור HLA II. בהשוואת BM-MSCs, WJ- ותאי הנגזרות CPJ היו גבוהים. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם הדיווחים הקודמים של UC הנגזרות 33 MSCs, 36, 37, 38. בנוסף, התוצאות שלנו הראו כי Cl-, WJ-, CPJ-, FP-MSCs הביע pluriגני עצמה כגון Oct4, NANOG, ו Sox2; עם זאת, הביטוי שלהם היה נמוך מזה של ESCs, כפי שדווח בעבר 39. תוצאות אלו היו גם הסכם עם מחקר קודם אשר דיווח הביטוי של סמני pluripotency בתאי סביב הלידה נגזרת 40. מעניין, זה היה נראה כי הביטוי של הסמן pluripotent היה גבוה ב CPJ-MSCs מאשר בתאים מבודדים ממקורות אחרים. זה גם היה שם לב כי UC-MSCs הציג פוטנציאל להתחדשות עצמית גדולה יותר BM-MSCs 41. מעניין לציין כי למרות דמיון במאפייני פנוטיפי, התאים המבודדים מארבעת המקורות היו ערכי CFE משתנים. עם זאת, למעט FP-MSC, וכולם היו טובים ערכים CFE מ BM-MSCs. CPJ-MSCs היה ערך CFE הגבוה ביותר וקצב ההתפשטות בהשוואה לכל MSCs האחר. בנוסף, WJ- ו CPJ-MSCs מוצגים פוטנציאלי בידול גבוהים יותר BM-MSCs. CL-MSCs הראה הבידול לפחותפוטנציאל לתוך כל שלוש שושלות (כלומר, adipogenic, chondrogenic, ו לסרטן העצמות), ואילו CPJ-MSCs היה פוטנציאל התמיינות trilineage הגבוהה ביותר FP-MSCs מוצג פוטנציאל התמיינות adipogenic לפחות.
לסיכום, התוצאות שלנו הראו כי איכות וכמות MSCs מבודד שונה בין ארבעת מקורות במדגם כבל / השליה. היה CPJ-MSCs יותר קיבולת התפשטות פוטנציאל התחדשות עצמית גדולה יותר. הם היו גם חזקים ב הבידול שלהם לתוך התאים מסוגי trilineage. בשל זמן ההכפלה הנמוך שלהם, CPJ-MSCs יכול להיות התרחב במהירות 1000-פי והשתמש עבור תרופת תפוקה גבוהה או הקרנה ביולוגית. תאים אלה יכולים להיות מקור מבטיח יותר עבור טיפול בתאים ויישומי רפואה רגנרטיבית.
The authors have nothing to disclose.
המחקר נתמך על ידי OU-WB ISCRM, אוקלנד אוניברסיטת מישיגן ראש מכון השדרה. נ Beeravolu ו ג מקי קבלו את פרס המחקר הבוגר המכללה מאוקלנד האוניברסיטה. אנו מעריכים ס בקשי לבחינת כתב היד.
DMEM with 4500 mg/ml glucose | Invitrogen | 11995065 | |
FBS | Aleken Biologicals | FBSS500 | |
Isobutyl-methylxanthine | Sigma | I5879-250mg | |
Dexamethasone | Sigma | D4902-100mg | |
Insulin | Prospec | CYT-270 | |
Indomethacin | Sigma | I7378-5G | |
TGFβ1 | Prospec | CYT-716 | |
Ascorbic acid | Sigma | A-7631 | |
Ascorbate 2-phosphate | Sigma | A-8960 | |
β-glycerophosphate | Sigma | G-6251 | |
TrypLE | Invitrogen | 50591419 | |
GeneJET RNA purification kit | Thermo Scientific | K0732 | |
DNase | Promega | M6101 | |
iScript kit | Biorad | 1708891 | |
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit | Biorad | 1725274 | |
4% paraformaldehyde | Affymetrix | 19943 | |
OCT | Thermo Scientific | SH75-125D | |
Oil Red O | American MasterTech Scientific | STORO100 | |
Toluidine blue | Thermo Scientific | S71363 | |
Crystal violet | Sigma | C3886 | |
Alizarin red stain | Thermo Scientific | S25131 | |
APC Mouse anti-Human CD29 | BD Biosciences | 559883 | |
APC Mouse anti-Human CD34 | BD Biosciences | 555824 | |
FITC Mouse anti-Human CD44 | BD Biosciences | 555478 | |
FITC Mouse anti-Human CD45 | BD Biosciences | 555482 | |
APC Mouse anti-Human CD73 | BD Biosciences | 560847 | |
FITC Mouse anti-Human CD90 | BD Biosciences | 561969 | |
APC Mouse anti-Human CD105 | BD Biosciences | 562408 | |
Centrifuge | IEC | 93522M-2 | |
CO2 incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | |
Light microscope (LM) | Nikon Instruments Inc. | Olympus | |
Hemacytometer | Thermo Scientific | 0267151B | |
Cryostat | Leica | CM3050 S | |
FACS Canto II and Diva Software | BD Biosciences | Canto II | |
Thermocycler | MJ Research Inc. | PTC-100 | |
Real-Time PCR System | Bio-Rad | CFX96 |