JoVE Journal > Developmental Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Developmental Biology

İnsan göbek bağı ve fetal plasentadan Mezenkimal Stromal Hücre İzolasyonu ve Vasıflandırılması

Published: April 03, 2017
doi:
10.3791/55224
, , , , , ,
1Department of Biological Sciences,Oakland University, 2OU-WB Institute for Stem Cell and Regenerative Medicine, 3Department of Obstetrics and Gynecology,St. John Provindence – Providence Park Hospital, 4Department of Neurosurgery,Beaumont Health System

Summary

Burada, insan göbek kordonu (UC) ve kord fetal plasenta örnek izolasyonu için (CL) Wharton jöle (WJ), kordon plasenta bileşke (CPJ) ve fetal plasenta (FP) astar diseksiyon için bir protokol mevcut ve eksplant kültürü tekniği kullanılarak mezenkimal stromal hücreler (MSC) karakterizasyonu.

Abstract

İnsan göbek kordonu (UC) ve plasenta herhangi etik veya ahlaki kaygıları poz yok çünkü giderek önem kazanmıştır mezenkimal stromal hücrelerin (MKH) arasında, non-invazif ilkel ve bol kaynaklarıdır. UC MSC izole edilmesi için güncel yöntemler değişken proliferasyon potansiyeli olan hücrelerin düşük miktarda elde edilmiştir. UC anatomik kompleks organ olması, MSC özelliklerindeki farklılıklar izolasyon anatomik bölgelerine farklılıklara bağlı olabilir. UC, kordon plasenta bileşke (CPJ) ve fetal plasenta (FP): Bu çalışmada, ilk üç ayrı anatomik bölgeye kord / plasenta örnekleri kesilmiştir. İkinci olarak, iki farklı bölgeler, kordon kaplama (CL) ve Wharton jel (WJ) ayrıldı. eksplant kültürü tekniği daha sonra dört kaynaklardan hücreleri izole etmek için kullanılmıştır. Eksplantlar hücrelerinin primer kültürü için gereken zaman doku kaynağına bağlı olarak değişmiştir. 4 da – hücre üremesi 3 içinde meydana gelensırasıyla, CL / WJ ve AP eksplantlardan 14 gün – 10 gün ve 11 – büyüme 7 sonra gözlenmiştir CPJ eksplantların ys. izole edilmiş hücreler plastik bağlanmış ve benzer şekilde, kemik iliği (BM) -türevi MSC'Iere, örneğin CD29, CD44, CD73, CD90 ve CD105 olarak fibroblastoid morfolojisi ve yüzey belirteçleri, göstermiştir. Bununla birlikte, CPJ-MSC ve WJ-MSC'Ier ile çeşitli hücrelerin koloni oluşturucu etkinlik, BM-MSC göre daha yüksek verimlilik gösteren. Dört kaynaklardan MSC multipotent olduğunu gösteren, adipojenik, kondrojenik ve osteojenik soylarına farklı. CPJ-MSC'ler diğer MSC kaynaklarına kıyasla daha etkili bir şekilde ayırt. Bu sonuçlar, CPJ en kuvvetli anatomik bölge ve in vitro olarak daha fazla proliferasyonu ve kendini yenileme kapasitesine sahip hücreler daha fazla sayıda, verimleri göstermektedir. Sonuç olarak, dört kaynaktan MSC karşılaştırmalı analizi CPJ hücre tedavisi, regenerativ için MSC bir daha umut verici bir kaynak olduğunu göstermiştiremedicine ve doku mühendisliği.

Introduction

Kök hücreleri çeşitli organlar ve dokular içinde mevcut bulunmaktadır. Onlar rejeneratif potansiyelinin sahip ve insan yaşamı 1, 2 ve span boyunca vücutta hasarlı dokuların onarılmasında önemli bir rol oynamaktadır. Bu, özellikle beri yetişkin kök hücrelerin (TSK), ilgi bir hayli üretti embriyonik kök hücreler (EKH) farklı olarak, TSK kullanılması ahlaki ve etik ikilemleri teşkil etmez. Pek çok çalışma, mezenkimal stromal hücreler (MSC) olarak ASC, izole edilmesini bildirmektedir; hematopoietik kök hücreler (HSC); ve adipoz dokusu (AT) ve pulpada 3, 4, 5, kemik iliği (BM) arasında değişen çeşitli yetişkin kaynaklar da dahil olmak üzere farklı progenitörler,. Bununla birlikte, yetişkin niş en sınırlıdır ve mevcut olan TSK sayısı, bunların izole edilmesi genellikle mümkün donör ile invazif ve ağrılı bir prosedür içerirSite morbidite. Buna ek olarak, verici yaşı ve çevresel stres de izole hücreler 6, 7, 8 kalitesini ve biyolojik aktivitesinin belirlenmesinde önemli bir rol oynayabilir. TSK ve ayrıca, in vitro olarak kültür sırasında sınırlı çoğalma ve farklılaşma potansiyeli göstermektedir.

Geçerli ASC'lerin Bu olumsuzlukların aşılması için, yeni kaynaklar kök hücreleri izole etmek için takip edilmiştir. Bu çabalar kordon kanı, kordon dokusu, plasenta ve sıvı 9 amniyotik dahil perinatal kaynaklardan kök hücrelerin izolasyonu yol açmıştır. Bu kaynaklar nedeniyle kolay ve bol kullanılabilirliği 10, 11, 12, 13 dikkatini kazanmıştır. bunlardan türetilen Ayrıca, perinatal dokular invaziv olmayan bir elde edilir ve kök olabilir hücrelerdirYetişkin kaynakları 14, 15 izole TSK daha ilkel. Doğumdan elde edilen dokulardan izole edilir ve bağlı yaşlanma ve çevresel stresler 16 genomunda en az değişiklikler uğramıştır sayılırlar.

Ancak, rapor perinatal kaynaklardan kök hücrelerin özellikleri ve onların potansiyel kendini yenilemek yanı sıra ayırt etmek, 17 yaygın 11 değişir. Bu durum, insan göbek kordonu (UC), kompleks bir organ olduğu gerçeğine kısmen olabilir. Perinatal doku ayrı ayrı bölümler varyasyonlar ve olmayan perinatal kaynaklardan elde edilen TSK göre, bu kök hücreler, daha ilkel doğası sorumlu olan spesifik niş oluşturmak varsayıyoruz. UC, kordon plasenta bileşke (CPJ), bir: Bu çalışma üç ayrı anatomik bölgeye kord / plasenta örneklerinin diseksiyon tarifd fetal plasenta (FP). UC ayrıca iki bölgeye kesitlere ayrılmıştır: kordon kaplama (CL) ve Wharton jöle (WJ). CL, WJ, CPJ ve FP izole hücrelerin analizi hepsi fibroblastoid morfoloji sergiledi ve MSC işaretlerini ifade olduğunu göstermiştir, ancak onların kendi kendini yenileme ve farklılaşma potansiyeli açısından farklıdır. bunların, hücre tedavisi, rejeneratif tıpta, doku mühendisliği için daha ümit verici bir kaynak yapma, UC- FP türetilmiş hücreler ile karşılaştırıldığında CPJ türetilmiş hücre proliferasyon ve kendini yenileme potansiyeli daha yüksek bir oranı sergilemiştir.

Protocol

Numuneler (n = 3) rıza alındı, Beaumont Hastanesi biyo-bankasındaki, Royal Oak, MI ve Providence Hastanesi, Southfield aracılığıyla sağlıklı donörler MI IRB # 820662- HIC- (HIC # 2012-101) ve IRB- (altında 3) sırasıyla protokolleri onayladı ve Oakland Üniversitesi, Rochester, MI IBC (# 2858) tarafından onaylanan işlemiştir. 1. İşleme insan göbek kordonu, kordon-plasenta Bağlantı ve fetal Plasenta ve izole hücreler CPJ bağlı olarak 6 cm ve – 3 – FP 4 cm aseptik UC 5 de dahil olmak üzere uzunluk olarak yaklaşık 10 cm, örnekleri toplamak. Hemen bir toplama kabına ihtiva eden bir ortam içinde, her numuneyi (DMEM 4.500 mg / ml glikoz ve antibiyotik çözeltisi (% 0.1 gentamisin,% 0.2 streptomisin ve% 0.12 penisilin)) ile, 4 ° C'de ve mağaza tarafından değerlendirilmiş laboratuara nakledilir kadar plastik bir kutu içinde, buz üzerine yerleştirerek. toplama 4 saat – 2 içinde 4 ° C de bir örnek işleyin. 150 mm Petri kabındaki numune yerleştirin devam ettibiyo emniyet dolabında buz. bir iğne ve şırınga kullanılarak, kan pıhtıları uzaklaştırmak için buz gibi soğuk PBS ile bir çok kez yıkayın. Numune işleme sırasında PBS ile ıslak tutulur ve kurumaya bırakın olmadığından emin olun. Sterilite sürdürme numune işleme boyunca otoklavlanmış PBS ve cerrahi aletler kullanılarak örneği aseptik işlemek için. Dikkatle farklı anatomik bölgelerini tespit etmek örneği inceleyelim: UC, CPJ ve FP. İlk UC teşrih. forseps ile UC fetal ucunu tutun ve dikkatli bir şekilde sadece bir makas kullanılarak CPJ üstündeki ilk kesim yapmak. FP – (2.0 cm x 1.5) CPJ altında ikinci kesik CPJ ayırmak için yapın. daha sonraki işlemler için ayrı bir Petri tabaklarında ayrılmış UC, CPJ ve FP yerleştirin. Tamamen kan damarları maruz bırakılmasını ve epitel bozmadan WJ çevreleyen, makas ve forsepsle yardımıyla uzunlamasına UC kesin. kan damarları ve subamnion iç epitel uzak WJ PençeBir neşter kullanılarak ve ardından kan damarlarını çıkarın. altında ve kan damarları çevresinde kalan perivasküler WJ toplamak ve ayrı petri toplanan WJ yerleştirmek için emin olun. ayrı bir Petri kabındaki kalan doku, kordon astar (CL), Collect. CL, WJ, CPJ ve FP temsil dokuların ayrılmasından sonra, 3 ile PBS yerine – Ticari tripsin solüsyonu, 5 mL ve ayrı ayrı makas kullanılarak 2 mm'lik parçalara 1- içine her bir doku kesilir. Numunelerin kısmen sindirilmesi için bir% 5 CO2 inkübatörde 30 dakika boyunca 37 ° C 'de ticari bir tripsin çözeltisi içinde doku parçaları inkübe edin. bir faz kontrast mikroskop kullanılarak hücre serbest görselleştirerek kısmi sindirim dikkate alınmalıdır. % 10 insan serumu / FBS ve antibiyotik çözeltisi (% 0.1 gentamisin,% 0.2 streptomisin ile takviye edilmiş 4,500 mg / ml glikoz ve 2 mM L-glutamin ile DMEM, kısmi olarak sindirilmiş bir numune için, kültür ortamı (CM eşit hacim kazandırmak ve% 0.12 senicillin)), ticari tripsin solüsyonu nötralize etmek. 50-ml santrifüj tüplerine içerik transferi ve kısmi olarak sindirilmiş bir doku parçaları 3 dakika razı. Dikkatle tek hücreler (de etkin bir şekilde genişlemeyen) de dahil olmak üzere yüzey maddesi aspire ve 15 plaka – 75 cm2 doku kültürü şişesi 20 kısmi olarak sindirilmiş bir doku parçaları ve CM 9 ml. 37 ° C'de inkübe edilir ve 2 için kültür şişeleri rahatsız olmayan – doku parçalarının yapışma sağlamak için 3 gün. Not: kısmi olarak sindirilmiş bir doku numunelerinin kalan kısmı hücrelerinin gelecek izolasyonu için dondurularak olabilir. 3 gün inkübasyondan sonra, CM değiştirebilir ve günlük bazda eksplanttan hücre büyümesinin görünüm aramak; 4 gün, 7 – – 10 gün ve 11 – sırasıyla CPJ, CL / WJ ve FP, inkübasyondan 14 gün hücre büyümesi 3 sonra, uçucu eksplantlar belirgin olmalıdır. Bu noktadan sonra, her 3 gün sonra ya da CM değiştirmekgerekli. Not: – 10 gün eksplanttan başlangıç ​​hücre büyümesinin sonra Hücre büyümesi 7% 70 izdiham ulaşır. onlar plastik uymak kadar yapışmayan doku parçaları herhangi hücre akıbet neden olmayacağını unutmayın. Şişe yapışık doku parçalarının sökülmesini önlemek için rahatsız edilmediği, böylece dikkatli olunmalıdır. Kulturlemenin ilk 3 gün sonra herhangi bir kayan parçalar varsa, bunlar eki için yeni bir balona aktarılarak kurtarıldı edilebilir. NOT: Doku eksplantlarınınkine hücre büyümesi% 70 izdiham ulaştığında, bunlar alt kültürleri alınmalıdır. sırasıyla 24 gün – 14 gün, 14 – – 20 gün ve 17, yukarıda belirtildiği gibi, CL / WJ, FP, CPJ gelen MSC ve 10 izdiham ulaşacaktır. Eksplantlar geçmek hücreleri alt-kültürü için, 1 kullanarak hücreleri ayırmak – ticari tripsin çözeltisi / 75 cm2'lik kültür şişesine 2 mL ve 3 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. 2 CM mL santrifüj 3 dakika boyunca 1,500 x g'de 1 – ile nötralize. YapmakHatta boyunca yayılan için tripsin eklerken şişeyi döndürmek için emin olun. Not: topaklanan hücreler pasaj 0 (P0) olarak kabul edilir ve CM içinde süspansiyon haline sayılır ve amplifikasyon, karakterizasyonu ve dondurulması için, 1 x 10 4 / cm2 'lik bir tohumlama yoğunluğunda alt-kültürlenmiştir. fazla hücreler P0 dondurularak saklanabilir. 2. İzole hücreler karakterize Koloni oluşturan etkinliği (CFE) deneyi Ceket, 37 ° C'de CO2 inkübatöründe 100 mm Petri kapları, 30 dakika boyunca% 0.1 jelatin ile (2 ile 60 cm yüzey alanı) ve koyun. NOT: gerekli değildir, jelatin kaplama hücre yapışmasını geliştirir, ancak. Fazla jelatin çıkarın ve / cm2 1.63 hücre konsantrasyonunda P0 hücreleri ile kaplanmış bir tabak tohum. 3 mL CM ilave edin ve 37 ° C'de CO2 inkübatöründe inkübe edin. klonal büyüme için seri başı plakaları inceleyinIşık mikroskobu (LM) tarafından her 3 günde bir orta değiştirmek. 10 sonra, – hücre büyümesi 14 gün, oda sıcaklığında 30 dakika süreyle% 4 paraformaldehid içinde hücreler, PBS ile iki kez Petri kapları yıkama ve düzeltin. NOT: Paraformaldehyde toksiktir. Kullanım sırasında eldiven ve gözlük takarak dikkatli pratik edin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 0.1 kristal mor ile sabitleştirilmiş hücreler Leke ve bağlanmamış mavi renk gidene kadar musluk suyu ile plaka yıkayın. LM kullanılarak en az 50 hücrelerden oluşan koloni sayısı. Hücre yüzeyi markerlerinin ifadesi Kültür% 70 ortak akışa kadar izole edilmiş hücreler, ticari tripsin solüsyonu ile ayrışan, ve 3 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleme ile, yıkama ve pelet. (% 2 FBS ve% 0.1 sodyum azid ile 1x PBS) FACS tampon hücreleri süspanse edin. NOT: Sodyum azid toksiktir. Kullanım sırasında eldiven ve gözlük takarak dikkatli pratik edin. <li30 dakika süre ile FACS tamponu içinde> (CD29, CD73 ve CD105: karşı CD44 ve CD90 ya da APC-konjuge antikor karşı FITC ile konjüge edilmiş antikor) FITC- ya da APC etiketli MSC-özgü antikorlarla hücreler (~ 10 6) Leke karanlıkta 4 ° C'da ısıtıldı. 5 dakika boyunca 670 x g'de boyanan hücrelerin santrifüj süpernatanı havalandırın, ve FACS tamponu 500 uL hücreler tekrar süspansiyon. üreticinin protokolüne uygun olarak FACS kullanılarak antikor lekeli hücrelerin analiz. 3. Farklılaşma Potansiyeli adipogenic farklılaşma Kültür% 70 ortak akışa kadar izole edilmiş hücreler, ticari tripsin solüsyonu ile ayrışan, ve 3 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleme ile, yıkama ve pelet. 37 ° C'de bir CO2 inkübatör içinde, kültür 100.000 hücre konsantrasyonunda hücre / kuyu CM 2 mL içeren bir 6-yuvalı plaka. 24 saat sonra, adipog ile CM yerineanjiyojenik farklılaşma ortamı (0.5 uM izobutil-metilksantin, 1 uM deksametazon, 10 uM insülini, ve 200 uM indometasin) ve inkübe edilir. 3 günde farklılaşma ortamı değiştirin veya sıklıkta gerekli. 3 haftalık inkübasyondan sonra, adipojenik farklılaşması için analiz etmek amacıyla, lipid damlacıkları üretimini tespit etmek için Yağlı Kırmızı O ile, oda sıcaklığı ve leke, 30 dakika boyunca oyuk başına% 4 paraformaldehid, 2 mL hücreleri düzeltmek. NOT: Paraformaldehyde toksiktir. Kullanım sırasında eldiven ve gözlük takarak dikkatli pratik edin. 5 dakika için% 60 izopropanol (6-çukurlu bir levhanın 2 ml / oyuk) ile sabitleştirilmiş hücreler tedavi edin. Yağ Kırmızı O leke 2 mL (filtre 3 pay Yağ Kırmızı O boya ve 2 parça damıtılmış su) ile izopropanol yerine, oda sıcaklığında 15-30 dakika inkübe ve 3 yıkayın – bağlanmamış leke çıkarmak için musluk suyu ile 4 kez . , U adipogenic hücre soyundan göstergesidir kırmızı lekeli lipit damlacıkları, görselleştirmeLM şarkı. kondrojenik farklılaşma % 70 ortak akışa kadar kültür izole edilmiş hücreler, ticari tripsin solüsyonu ile ayrışan, ve PBS ile yıkayın. 8 dakika için 11,000 x g'de kondrojenik indüksiyonu, santrifüj CM 2 mL bir 15-ml santrifüj tüpü içinde 250,000 hücre için, hücreleri topaklamak üzere. gece boyunca 37 ° C 'de pelet inkübe edin. 24 saat sonra, yavaşça pelet bozmadan kondrojenik farklılaştırma ortamının (TGF-P 1 ng 20, 10 ng insülin, 100 nM deksametason ve 100 uM askorbik asit) ile CM yerine ve inkübasyona devam. 3 günde farklılaşma ortamı değiştirin veya sıklıkta gerekli. 3 haftalık inkübasyondan sonra, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca oyuk başına% 4 paraformaldehid, 2 mL hücreleri düzeltmek. % 1 toluidin mavisi ile Cryosection ve leke kondrojenik farklılaşmasını belirlemek amacıyla hücre dışı matrisin varlığı veya üretimini incelemek. NOT: Paraformaldehyde toksiktir. Kullanım sırasında eldiven ve gözlük takarak dikkatli pratik edin. cryosectioning için, PBS ile iki kez toplandı hücre pelletleri yıkama ve oda sıcaklığında 30 dakika süreyle% 4 paraformaldehid 1 mL sabitleyin. NOT: Paraformaldehyde toksiktir. Kullanım sırasında eldiven ve göz aşınmasını giyerek dikkatli pratik edin. paraformaldehit çıkarın ve bir sükroz / OCT çözelti içine transfer etmek için iki kez PBS ile yıkayın pelet (1: 2,% 20 Sakroz: OCT). Çözelti, hücre pelletleri girmesine izin vermek için 24 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir; Bu pürüzsüz bölümlendirilmeleri sağlayacaktır. Ekim kalıplar içine granül aktarın. 6 saat ve cryosection yaklaşık 10 – – toluidin mavi boyama için bir kriyostat kullanarak hücre peletlerinin 12 mikron kalınlığında kesitler 4 -20 ° C 'de kalıplar dondurun. PBS ile hafifçe cryosections yıkayın; Tamamen slayt topak bölümleri kapsayan,% 1 toluidin mavisi boyası birkaç damla ekleyin; ve incOda sıcaklığında 1 saat süre ile Ubate. destain için PBS birden çok kez birlikte slaytlar yıkayın. (% 95 HCI alkol + 0.5 mL) birden çok kez, bağlanmamış mavi renk gidene kadar HCI-bazlı alkol solüsyonu içinde slayt batırılarak Boya fazlasını uzaklaştırmak. Slaytlar uzun süreli korunması için bir çözüm montaj 100 uL kullanılarak boyandı bölümleri monte edin. NOT: bölümlerden mavi boyama glikozaminoglikanların ve glikoproteinlerin varlığını gösterir ve LM kullanarak gözlemlenebilir olacak. osteojenik farklılaşma Yine, kültür% 70 ortak akışa kadar izole edilmiş hücreler, ticari tripsin solüsyonu ile ayrışan, ve 3 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüjleme ile, yıkama ve pelet. 37 ° C'de bir CO2 inkübatör içinde CM 2 mL içeren bir 100,000 hücre / kuyucuk konsantrasyonla 6-yuvalı plakalar hücreleri alt-kültür. 24 saat sonra, (osteojenik farklılaşma ortamı ile 0.1 ^ ı CM yerineM deksametason, 10 uM β-gliserofosfat, 50 uM askorbat fosfat) ve inkübasyona devam. 3 günde farklılaşma ortamı değiştirin veya sıklıkta gerekli. 3 haftalık inkübasyondan sonra, osteojenik farklılaşma belirlemek amacıyla bir kalsiyum birikimi varlığını tespit etmek için, oda sıcaklığı ve alizarin kırmızı leke, 30 dakika boyunca oyuk başına 2 mL% 4 paraformaldehit ile hücrelerin tespit. NOT: Paraformaldehyde toksiktir. Kullanım sırasında eldiven ve gözlük takarak dikkatli pratik edin. Yavaşça damıtılmış su ile iki kez, sabit hücreleri yıkayın ve% 2 alizarin kırmızı leke ile tedavi (2 ml / oyuk, 6 oyuklu bir plaka içerisinde), karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat karıştırıldı. kireçlenme çıkarmak olmayan şekilde hafifçe musluk suyu ile yıkanarak Boya fazlasını uzaklaştırmak. LM kullanarak kırmızı lekeli kireçlenme Görselleştirin. 4. ters transkriptaz polimeraz ChaReaksiyon (qRT-PCR) analizi 3 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj ile% 70 ortak akışa kadar izole edilmiş hücreler, ticari tripsin solüsyonu ile ayrışan yıkama Kültür ve topak toplam hücresel RNA izole etmek için. Hücrelerin PBS ile yıkayın FBS kalıntılarını uzaklaştırmak ve sonra, imalatçının talimatları izlenerek bir ticari RNA saflaştırma kiti kullanılarak RNA izolasyonu geçin. bir thermocycler kullanılarak 30 dakika boyunca 37 ° C 'de DNaz ile muamele etmek suretiyle izole edilmiş total RNA saflaştırılır. cDNA üreticinin talimatlarına aşağıdaki ticari kiti kullanılarak sentezle. SYBR yeşili PCR SuperMix 5 uL ihtiva eden, her bir reaksiyon ile, 96 oyuklu bir plaka içerisinde, üçlü 10-uL PCR reaksiyonları hazırlamak; iki kez damıtılmış su için 3 uL; her bir primerden 0.5 uL, ileri ve geri; ve sulandırılmış (1:10) olduğu 1 ul cDNA. aşağıdaki parametreler altında PCR yapın: 30 s, her biri 44 döngü izledi 98 ° C'de 10 dakika, 98 ile176. C, 60 ° C 'de 20 saniye ve 72 ° C'de 30 s. Referans genler, GAPDH ve β-aktin için, hedef genlerin amplifikasyonu normalize; Primer dizileri Tablo 1'de verilmiştir. 5. İstatistiksel Analiz İstatistiksel yazılımı kullanarak tüm analizler gerçekleştirin. Ortalama ± SEM olarak veriler sunulmuştur. bir p-değeri ile elde edilen sonuçlar (s ≤ 0.05 ≤ 0.01 * p **) istatistiksel olarak önemli kabul edilmiştir.

Representative Results

Diseksiyon ve insan göbek kordonu, kordon-plasenta bileşke ve fetal plasentadan Hücrelerin İzolasyonu Perinatal doku üç ayrı anatomik bölgeden oluşur. CL (kordun dış kaplama) ve WJ (kablo içindeki kan damarları çevreleyen jöle-benzeri malzeme): İlk iki arter ve bir damar, aynı zamanda iki farklı bölge içeren UC olup. İkinci CPJ (kablosu ve plasenta arasında bağlantı) ve üçüncü (kordon annenin rahim duvarına bağlı olan plasenta, yerleşen) CPJ hemen sonra FP vardır. Perinatal dokudan hücrelerin izolasyonu protokol şeması Şekil 1 'de tasvir edilmiştir. Dört kaynak-CL WJ CPJ ve net olarak tanımlanabilir AP-ve Şekil 2'de gösterildiği gibi, eksplantlar hücreleri izole etmek için ayrıldı. Teksplant kültürlerden hücre üremesinin o görünüm rutin izlenir ve LM tarafından kaydedildi. Yapışık fibroblastoid hücreler CPJ kültür eksplantlar 3-4 gün sonra gözlenmiştir. benzer morfolojik sahip hücreler sırasıyla WJ, CL ve FP kültür eksplantlar sonra 7-8, 9-10 ve 11-14 gün ortaya çıktı. Çeşitli kaynaklardan (CL WJ, CPJ ve AP) temsil eden eksplantlardan hücrelerinin aşırı büyüme Şekil 3A'da gösterilmiştir. Bu hücreler P0 olarak kabul edildi. P0 hücrelerin alt kültürleri yapılmıştır, bunlar BM-MSC'lerin benzer bir fibroblastoid morfoloji, klonal büyümeye çıktı. Bununla birlikte, Şekil 3B ve C'de gösterildiği gibi, 32 saat ila CPJ ve AP hücreler için 94 saat arasında değişen, nüfus katlanması zaman farklılıklarını sergilemiştir. WJ ve CL Hücreler benzer katlama süreleri CPJ ve FP medialinden vardı. P0 hücrelerinin daha fazla analizi, aynı zamanda 16 ile 92 koloni kadar, CFE değiştirilebilir olduğunu göstermiştir.FP hücreleri düşük (16) CFE varken CPJ alınan hücreler, yüksek (92) vardı. CL ve WJ alınan hücreler 59 ve 80 koloni, sırasıyla (Şekil 4A-C) CFE değerlerine sahipti. CL hücreleri BM-MSC'Iere benzer CFE değerleri vardı. Bu sonuçlar CPJ kökenli hücreler daha yüksek proliferatif ve kendini yenileme yetenekleri var olduğunu göstermektedir. İzole Hücre Immunoprofile CL, WJ, CPJ ve FP izole hücreler hücreye özel markörlerin ekspresyonu için incelenmiştir. P3-5 hücreler, CD29, CD44, CD73, CD90 ve CD105 (Şekil 5A ve B) olarak MSC işaret açısından pozitif ifadesi sergilemiştir. Bu hücreler ayrıca, işaretini HLA-ABC ve sınıf II işaretleyici, HLA-DR 3 ifade etmezler majör doku uyuşması sınıfını ifade etmek bilinmektedir. th için pozitif hücrelerin yüzdeleriDört kaynaklarından seçilen belirteçler, standart BM-MSC'Ier ifade edilene benzerdi ese. Bununla birlikte, MFI oranları WJ- ve CPJ türetilmiş hücreler hemen hemen benzerdir ve Cl FP türetilmiş hücreler (Şekil 5C) daha yüksek olduğunu göstermektedir. İlginç bir şekilde, CFE değişen değerlere rağmen, farklı kaynaklardan gelen tüm hücreler MSC belirteçlerin benzer seviyelerde ifade edilmiştir. hücre yüzeyi markerlerinin sonuçlarına göre, dört kaynaklardan izole edilmiş hücreler MSC olarak kabul edildi. Bu hücrelerin daha fazla analizi, Şekil 5D'de gösterildiği gibi, aynı zamanda, pluripotense genleri, OCT-4'ü, Nanog, Klf4 ve Sox2 eksprese olduğunu ortaya koydu. CPJ-MSC'ler WJ-, Cl- ve FP-MKH takip Pluripotency belirteçlerinin en yüksek ifadesini vardı. İzole MSC nin Farklılaşma Potansiyeli Mezenkimal karakterizasyonu için altın standart yönün edebilme yetenekleridirbirden fazla soy içine rentiate. Sonuçlarımız, perinatal kaynakların her izole MSC'ler, hali hazırda, adipojenik kondrojenik ve osteojenik hücre türlerine göre göstermiştir. Adipojenik türevleri Şekil 6A'da gösterildiği gibi, pozitif, Yağ Kırmızı O ile boyanmıştır lipid damlacıkları üretti. MSC'lerin kondrojenik türevinin Toluidin mavisi ile boyanması hücre dışı matrisin (Şekil 6B) üretiminde destekli proteoglikanlar ve glikoproteinlerin varlığını göstermiştir. Şekil 6C'de gösterildiği gibi, pozitif alizarin kırmızısı ile boyanmış MSC'lerin osteojenik türevleri, kemik mineralizasyonu katılan kalsiyum birikimleri varlığının işaret etmektedir. Beklendiği gibi, tüm kaynaklardan izole edilmiş MSC transkripsiyonel analizi trılıneage farklılaşmasını (Şekil 6D, -F) gösterdi. Fakat kapfarklılaşma durum esas teşkil MSC'Ier kaynağına bağlı olarak değişmiştir. WJ-MSC'lerin adipojenik türevleri CPJ-MSC kıyasla seçilen adipojenik genin (CEBPβ, FABP4 ve PPARy) daha ekspresyon seviyelerini 2-kat vardı. CL ve AP-MSC bu genlerin düşük ekspresyonu vardı. kondrojenik farklılaşma durumunda, CPJ-MSC türevleri WJ- FP-MSC'ler türevlerinin daha yüksek 50-kat kondrojenik genleri (SOX9 ve COL2) seçilen dile. CL-MSC'lerin zayıf adipojenik farklılaşma benzer şekilde, bu kondrojenik genlerin düşük ekspresyonu ile belirgin olarak daha düşük kondrojenik potansiyeline sahipti. Seçilen osteojenik gen (Col1 APN ve OCN) 2-kat daha yüksek transkript seviyelerinin işaret ettiği gibi CPJ-MSC'ler da yüksek osteojenik farklılaşma potansiyelini göstermektedir. Bununla birlikte, progenitör markör Runx2 ekspresyonu, bu hücrelerin farklılaşma koşullara yanıt yavaş belirten WJ-MSC osteojenik türevlerinin en yüksek idi. Yine, CL-MSC'ler kötü gösterdiosteojenik soy farklılaşma. Bu sonuçlar, CPJ-MSC ve WJ-MSC Cl- ve AP-MSC'Ier daha büyük bir farklılaşma potansiyeli gösterilen düşündürmektedir. CL-MSC trılıneage türevlerine ayırt etmek için düşük bir potansiyele sahip. Şekil 1: insan göbek kordonu, kordon-plasenta bileşke ve fetal plasentadan Hücrelerin İzolasyonu şematik. Toplanan örnek inceleyin ve diseksiyon devam edin. 1. el incelemek ve üç ayrı bölgeye kord / plasenta örneği ayrı Aşama: göbek kordonu (UC), kordon plasenta bileşke (CPJ) ve fetal plasenta (FP). kordon astar (CL) ve Wharton jöle (WJ) makasları ve forsepsler kullanarak içine UC iki ayrı bölge ayırın. 2. Adım. 1-t ayrı ayrı parçalara her bir doku kesipo 2 mm'lik parçalar makas kullanılarak kısmen parçaları sindirimi. Adım 3. Kültür doku parçaları. Adım 4. tripsin muamelesi ile eksplantlardan hücreleri izole edin. Alt kültür ve izole hücreler karakterize etmektedir. Adım 5. İzole edilmiş ve karakterize edici özelliği hücrelerin amplifiye edildi ve çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. Şekil 2: insan göbek kordonu, kordon-plasenta bileşke ve fetal plasentadan Diseksiyon ve eksplant kültürü. UC (bölünmüş CL ve WJ içine), CPJ ve FP, aynı zamanda ilişkili arterler ve venler: Üç farklı anatomik kord / plasenta numune bölgeleri gösterilmiştir. CL WJ CPJ,FP Eksplantlar hücreleri izole etmek için el diseksiyon ile ayrıldı. Disekte bölgelerin her biri ayrı ayrı CM 9 mL kullanılarak 2 tabak küçük parçalar halinde kesilmiş ve 75 cm kültürlenir. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. Şekil 3: insan göbek kordonu, kordon-plasenta bileşke ve fetal plasentasından izole Hücrelerin morfolojisi. LM ile gösterildiği gibi CL, WJ, CPJ ve FP eksplantlarından (A) Celi sonucudur. CL, WJ, CPJ ve AP eksplantlar izole hücrelerin (B) Alt kültür fibroblastoid morfoloji gösterdi. ölçek çubuğu 100 um (: 4X büyütme) göstermektedir. (C) nüfus t ikiye katlanma süresiO CL, WJ, CPJ ve FP hücreleri izole edilmiştir. BM-erişkin standart olarak kullanılmıştır. Hata barları triplet ölçümlerin ortalamasından bir standart sapmayı temsil etmektedir (** p ≤ 0.05 ≤ 0.01 * p). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. Şekil 4: Koloni oluşturan insan göbek kordonu, kordon-plasenta bileşke ve fetal plasentadan Hücrelerin Verim. 1.63 hücre / cm2, bir klonal yoğunlukta kaplama CL, WJ, CPJ ve FP izole edilmiş hücre (P0) (A) Büyüme, LM ile görüntülenmiştir. (B), kristal viyole koloni oluşturma kapasitesini gösteren ile boyanmış hücreler fotomikrografları. (C), hücreler boyanmış wit Tek kolonih kristal viyole. ölçek çubukları 100 um (: 4X büyütme) temsil eder. (D) CL, WJ, CPJ ve FP türetilen hücrelerden oluşan koloni sayısı grafiksel temsili. BM-erişkin standart olarak kullanılmıştır. Hata barları triplet ölçümlerin ortalamasından bir standart sapmayı temsil etmektedir (** p ≤ 0.05 ≤ 0.01 * p). Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. Şekil 5: insan göbek kordonu, kordon-plasenta bileşke ve fetal plasentasından izole hücreler tarafından ifade edilen MSC İşaretlerinin analizi. Caydırmak olarak (A) 'CL, WJ, CPJ ve FP hücreler tarafından mezenkimal yüzey belirteçleri (CD29, CD44, CD73, CD90, ve CD105) sentezlenmesi,Akış sitometrisi ile çıkartılmaktadır. (B ve C) mezenkimal yüzey işaretleyicileri için pozitif hücrelerin yüzdeleri ve ortalama floresan yoğunluğu (MFI) oranları grafiksel temsili. MFI oranları izotipinin MFI değeri (anahtarlı hücre popülasyonlarının floresan yoğunluğuna göre yazılımı tarafından üretilen) markörün MFI değerine bölünmesiyle hesaplandı. Hata çubukları üç ölçümden ortalamanın standart hatasını temsil eder. QRT-PCR ile belirlendiği üzere CL, WJ, CPJ ve FP hücreler tarafından pluripotense genleri (OCT4, Nanog, Klf4 ve Sox2) (D) ekspresyonu. (** p ≤ 0.01 * p ≤ 0.05). Gen ekspresyonu GAPDH ve β-aktin için normalize edildi ve hata çubukları üç ölçümün ortalaması ve standart hatasını temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. <p class=fo "jove_content": keep-together.within-sayfa = "1"> Şekil 6: insan göbek kordonu, kordon-plasenta bileşke ve fetal plasentasından izole MKH'lerin multilineage farklılaşması. (A) Hücreleri lipid damlacıkları varlığını gösteren, 3 hafta boyunca adipojenik farklılaşma ortamında inkübe edilmiş ve Yağlı Kırmızı O ile boyanmıştır. (B) Hücre topakları 3 hafta boyunca kondrojenik farklılaşma ortamı içinde inkübe edildi. Pelet kültürlerinin histolojik halinde kriyoseksiyonlar glikozaminoglikanların varlığını gösteren, toluidin mavisi ile lekelenmiştir. (C), hücreler, kemik mineralizasyonu öne kireçlenme üretimini gösteren, 3 hafta boyunca osteojenik farklılaşma ortamında inkübe edilmiş ve alizarin kırmızısı ile boyandı. Bütün resimler LM ile elde edilmiştir. ölçek çubuğu 100 um (: 4X büyütme) göstermektedir. BM-MSC'ler bizBir standart olarak kullanılmaya başlandı. (DF) seçilen genlerin sentezlenmesi (CEBPβ, FABP4 ve PPARy; SOX9, açan ve COL2 ve Col1, Runx2, adipojenik, kondrojenik ve sırasıyla osteojenik soy, MSC farklılaşmasını temsil APN ve OCN), tespit edildiği üzere qRT-PCR analizi ile (** p ≤ 0.05 ≤ 0.01 * p). Gen ekspresyonu GAPDH ve β-aktin için normalize edildi ve hata çubukları üç ölçümün ortalaması ve standart hatasını temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın. Gen Astar Diziler Ürün boyu OCT4 İleri-CCCCTGGTGCCGTGAA 97 Ters-GCAAATTGCTCGAGTTCTTTCTG </ Td> nanog ileriye AAAGAATCTTCACCTATGCC 110 revers- GAAGGAAGAGGAGAGACAGT Klf4 ileriye CGAACCCACACAGGTGAGAA 94 revers- TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC Sox2 ileriye TTGCTGCCTCTTTAAGACTAGGA 75 revers- CTGGGGCTCAAACTTCTCTC SOX9 ileriye AGCGAACGCACATCAAGAC 85 revers- CTGTAGGCGATCTGTTGGGG COL2 ileriye CTCGTGGCAGAGATGGAGAA 252 revers- CACCAGGTTCACCAGGATTG ACAN ileriye AGCCTGCGCTCCAATGACT 103 <td> ters-GGAACACGATGCCTTTCACC col1 ileriye AAGGTCATGCTGGTCTTGCT 114 revers- GACCCTGTTCACCTTTTCCA Runx2 ileriye TGCTTCATTCGCCTCACAAA 111 revers- AGTGACCTGCGGAGATTAAC OPN ileriye CATACAAGGCCATCCCCGTT 112 revers- TGGGTTTCAGCACTCTGGTC OCN ileriye TAAACAGTGCTGGAGGCTGG 191 revers- CTTGGACACAAAGGCTGCAC CEBPβ ileriye TATAGGCTGGGCTTCCCCTT 94 revers- AGCTTTCTGGTGTGACTCGG FABP4 ileriye TTAGATGGGGGTGTCCTGGT 158 revers- GGTCAACGTCCCTTGGCTTA PPARy ileriye GGCTTCATGACAAGGGAGTTTC 74 revers- ACTCAAACTTGGGCTCCATAAAG GAPDH ileriye ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG 101 revers- GCCATCACGCCACAGTTTC ACTIN ileriye AATCTGGCACCACACCTTCTAC 170 revers- ATAGCACAGCCTGGATAGCAAC Tablo 1: Bu Çalışmada Kullanılan İnsan Astar Dizilerin listesi.

Discussion

Kök hücre araştırmalarında son gelişmeler, temel gelişim süreçlerinin anlaşılmasını sağlamıştır hem de biyoteknolojik, ilaç, hücre terapisi, rejeneratif tıp, doku mühendisliği ve 18, 19, 20 kök hücrelerin kullanımı için umut verici fırsatlar sağladı sadece. Erken embriyolardan izole pluripotent EKH en umut olsa da, teknik zorluklar ve etik ikilemleri 21, 22, 23 karşıyadır. Yetişkin hücrelerinden türetilen uyarılmış pluripotent kök hücreler (iPSCs) bir alternatif sağlar, ancak çok benzer teknik ve güvenlik sorunları 23 bakmaktadır. Ayrıca, iPSCs genetik olarak stabil olabilir veya bu şekilde bunların terapötik kullanımı sınırlıdır uygulanan genetik değişiklikler olabilir. Kök hücre ayrıca doğum sonrası tis çeşitli bildirilmiştirdava açıyor ve organlar. Bu ASC'lerin en yaygın kaynakları kemik iliği, yağ ve kas dokusu vardır. Bununla birlikte, doğum sonrası kaynaklardan TSK büyüme ve farklılaşma potansiyeli 24, 25 sınırlıdır. Onlar da bağlı yaşlanma ve çevresel streslere maruz kalma için ıstırap ve böylece her zaman tedavi edici uygulamalar 26, 27, 28 için etkili değildir. Bu TSK daha naif kabul kök hücrelerin yeni kaynaklar aramak için bizi ve başkalarını yol açmıştır.

Biz TSK alternatif olarak ilkel kök hücreleri için perinatal kaynakları araştırdık. Bu raporda, kordon / plasentanın örneklerinden insan MSC izole etmek için bir güvenilir, sağlam ve basit bir yöntem sağlar. TSK izolasyonu için kullanılan diğer kaynaklar ve yöntemlere kıyasla, bu yöntem son derece deneyimli v büyük miktarlarda izole edilmesi için etkin ve invazif olmayan bir yöntem sağlarh kaliteli MSC. Bundan başka, bu tür BM gibi yetişkin kaynaklardan MSC ile karşılaştırıldığında perinatal MSC daha yüksek büyüme ve farklılaşma potansiyeli vurgular.

plasenta fetüsü bağlama UC iki arter, bir damardan, CL da dahil olmak üzere farklı anatomik bölgelerine sahip büyük bir organdır ve WJ (kan damarlarını çevreleyen doku). Pek çok çalışma, değişken büyüme ile bütün kordun, WJ, ya da plasentadan MSC izolasyonunu bildirmiştir ve farklılaşması, 29 25 potansiyelleri. Bununla birlikte, bugüne kadar hiçbir çalışma etkin bir şekilde incelenmiş ve kordon / plasenta numunenin farklı anatomik bölgelerden hücreleri karşılaştırılmıştır. Biz burada UC, CPJ diseksiyonu için sistematik ve basit bir yöntem sağlamak ve MSC'lerin izolasyonu için FP bağladı. Biz de onların çoğalması Capabil belirleyerek karakterize ve izole hücrelerin kalitesini değerlendirmek için kapsamlı ve basit bir protokol göstermekrinin yanı sıra bunların kendini yenileme ve farklılaşma potansiyelleri. Bu yöntem, yeniden üretilebilir ve üstün kaliteli MSC büyük miktarda elde edilir.

Bu tek bir hücre içine doku tam bir sindirim izole hücrelerin zayıf verim sağlar oysa büyüklüğü doku parçaları 1-2 mm kısmi sindirimi, eksplantlar ticari bir tripsin solüsyonu yeniden üretilebilir vermiştir hücreleri kullanılarak tespit ettik. Bununla birlikte, tek bir çalışma UC büyük doku eksplantlarında boyutu yaklaşık olarak 10 mm'lik bir hücre izolasyonu 30 için en uygun olduğu bildirilmiştir. Bunun aksine, bir başka çalışma doku eksplantı yöntemi enzim sindirimi yöntemi 31 ile karşılaştırıldığında daha uzun bir kültür döngüsü ve hücre alt verimi ile sonuçlanmıştır önerdi. Daha önceki raporlarda, kordonun tedavi kollajenaz II ve hiyaluronidaz, ayrı ayrı ya da tripsin aşağıdaki dokular, kordon hücreleri 32, 33 izole etmek için gerçekleştirilmiştir <sup> 34. Sadece önceden kültüre edilmeye kordon dokusunun sindirim yöntemlerinde varyasyonun bir çok şey var, ama aynı zamanda izole hücreler heterojen olduğu ortaya çıktı. daha uzun süreler için sert enzimlerin kullanımı, hücre yapışmasını ve çoğalmasını etkileyen hücre zarı düşürebilir. Bu yöntemin sonucu, kısmen sindirilmiş perinatal doku eksplantlarında geniş hücre zarar vermeden hücrelerinin aşırı büyümesini sağladığını göstermiştir canlılığını muhafaza ve MSC homojen popülasyonları yüksek miktarda elde edildi.

eksplantlardan hücrelerin diseksiyon ve izolasyonu için protokol basit olmakla birlikte, bazı adımları zor kanıtlanabilir. İlk olarak, kültür şişesine yüzeyine bağlılığını sağlayarak eksplant yapışmasını sağlamak. Bu, yalnızca kültürün ilk 2 saat boyunca doku parçaları kapsayan, ve daha sonra dikkatli bir şekilde geri kalan ortam ilave, orta bir miktar kullanılarak kolaylaştırılabilmektedir. Second, T75 şişesi başına en az 15 eksplant sayısını sınırlar. parçalar ya da bir şişe başına çok fazla parçaları arasında çok küçük bir boşluk hücre büyüme için inhibitördür. 3 gün inkübasyondan sonra kültür şişesi yüzeyine sopa yok Üçüncüsü, doku parçaları bağlılık ve kültürünün oluşturulması için yeni bir balona transfer edilmelidir. Dördüncü olarak, hedef doku parçaları yapışmasını engellediği hücre artıkları, arındırılmış olmalıdır kültürlenebilir için. Beşinci olarak, büyük parça kültürü daha bir ortama gereksinim ve hücre akıbet verimliliğini artırmak etmez. Hücreler hızla konfluent hale gelir ve doku kaynağı bağlı olarak ayırt edilebilir şekilde Son olarak, özellikle hücre büyümesinin ortaya çıktıktan sonra, yakından eksplant kültürleri izler. tekniğin birkaç kısıtlama CL, WJ, CPJ ve FP ayırmak için numune kesme uzmanlık eksikliği yer alır; Düşük WJ verimle elde edilmiştir, küçük bir numune boyutu; ve gecikmiş işleme numuneler AvO için toplama 2-4 saat içinde işleme için gerekli olanid hücre kurtarma kaybı.

MSC karakterizasyonu için altın standardı, plastik bağlı fibroblastik fenotip oluşturan ve çok soylarına ayırt yeteneğidir. Bunlar aynı zamanda ISCT 35 tarafından tarif edildiği gibi MSC tanımlamak için yaygın olarak kullanılan bir kriterdir. Bu çalışmada, dört kaynaklardan izole edilen hücreler plastik bağlanmış ve MSC belirteçleri (CD29, CD44, CD73, CD90, ve CD105), fakat hematopoietik işaretleyici CD45 için negatif ifadesi için pozitif olarak ifade vardı. Buna ek olarak, insan lökosit antijen (HLA) klas I ifade ama HLA sınıf II negatif idi. BM-MSC ile karşılaştırıldığında, WJ- ve CPJ türetilmiş hücreler daha yüksekti. Bu sonuçlar, daha önceki raporlar ile uyumludur MSC'ler 33, 36, 37, 38, UC-türevi. Buna ek olarak, sonuçlar CL, WJ-, CPJ- FP-MSC'ler pluri eksprese olduğunu gösterdiörneğin OCT4, Nanog ve Sox2 gibi güç genleri; Daha önce 39 bildirildiği gibi ancak, bunların ifadesi, ESC'lennin daha düşüktü. Bu sonuçlar, perinatal türetilmiş hücreler 40 pluripotense markerlerin ifadesi bildirilen daha önceki bir çalışma ile uyum içindeydi. İlginç bir şekilde, pluripotent işaretleyicinin ifadesi başka kaynaklardan izole edilmiş hücreler daha CPJ-MSC'Ier daha yüksek olduğu gözlenmiştir. Ayrıca UC-MKH'ler BM-MKH 41 daha büyük kendini yenileme potansiyelini sergiledi fark edildi. İlginç bir şekilde, fenotipik özellikleri aynı olsa da, dört kaynaklardan izole edilmiş hücreleri değişken CFE değerlerine sahip olmuştur. Ancak, FP-MSC hariç, hepsi BM-MKH daha iyi CFE değerleri vardı. Diğer tüm MSC'Iere karşılaştırıldığında CPJ-MKH'ler en yüksek çoğalma CFE değeri ve oranı vardı. Buna ek olarak, WJ- ve CPJ-MSC'ler BM-MSC'Ier daha yüksek farklılaşma potansiyelleri gösterilir. CL-MSC'ler az farklılık gösterdiCPJ-MSC'Ier ise üç soyları (yani, adipojenik, kondrojenik ve osteojenik) içine potansiyeli yüksek trılıneage farklılaşma potansiyeli olduğunu ve AP-MSC'ler az adipojenik farklılaşma potansiyelini göstermiştir.

Sonuç olarak, sonuçlar izole MSC kalitesi ve miktarı kord / plasenta örneğinde dört kaynakları arasında farklılık gösterdi. CPJ-MSC'ler fazla çoğalma kapasitesi ve daha kendini yenileme potansiyeline sahipti. Ayrıca trılıneage hücre tipleri içine farklılaşmasında kuvvetli olmuşlardır. Nedeniyle düşük iki katına çıkma süresi için CPJ-MSC'ler vakit kaybedilmeden 1,000 kat genişledi ve yüksek verimli ilaç ya da biyomalzeme tarama için kullanılan olabilir. Bu hücreler, hücre terapisi ve rejeneratif tıp uygulamalarında daha umut verici kaynağı olabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Çalışma OU-WB ISCRM, Oakland Üniversitesi ve Michigan Başkanı ve Omurga Enstitüsü tarafından desteklendi. N. Beeravolu ve C. McKee Oakland Üniversitesi'nden Provost Lisansüstü Araştırma Ödülü aldı. Yazıları inceleme S. Bakshi teşekkür ederiz.

Materials

DMEM with 4500 mg/ml glucose  Invitrogen 11995065
FBS Aleken Biologicals FBSS500
Isobutyl-methylxanthine Sigma I5879-250mg
Dexamethasone Sigma D4902-100mg
Insulin Prospec CYT-270
Indomethacin Sigma I7378-5G
TGFβ1 Prospec CYT-716
Ascorbic acid Sigma A-7631
Ascorbate 2-phosphate Sigma A-8960
β-glycerophosphate Sigma G-6251
TrypLE Invitrogen 50591419
GeneJET RNA purification kit Thermo Scientific K0732
DNase Promega M6101
iScript kit Biorad 1708891
Sso-Advanced Universal SYBR Green Supermix Kit Biorad 1725274
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943
OCT Thermo Scientific SH75-125D
Oil Red O  American MasterTech Scientific STORO100
Toluidine blue Thermo Scientific S71363
 Crystal violet Sigma C3886
Alizarin red stain Thermo Scientific S25131
APC Mouse anti-Human CD29 BD Biosciences  559883
APC Mouse anti-Human CD34 BD Biosciences  555824
FITC Mouse anti-Human CD44 BD Biosciences  555478
FITC Mouse anti-Human CD45 BD Biosciences  555482
APC Mouse anti-Human CD73 BD Biosciences  560847
FITC Mouse anti-Human CD90 BD Biosciences  561969
APC Mouse anti-Human CD105 BD Biosciences  562408
Centrifuge IEC 93522M-2
CO2 incubator Thermo Scientific Hera Cell 150i
Light microscope (LM) Nikon Instruments Inc. Olympus
Hemacytometer Thermo Scientific 0267151B
Cryostat Leica CM3050 S
FACS Canto II and Diva Software BD Biosciences  Canto II 
Thermocycler MJ Research Inc. PTC-100
Real-Time PCR System  Bio-Rad CFX96
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Upadhyay, R. K. Role of regeneration in tissue repairing and therapies. J Regen Med Tissue Eng. 4 (1), 1 (2015).
  2. English, K., Mahon, B. P., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells; role in tissue repair, drug discovery and immune modulation. Curr Drug Deliv. 11 (5), 561-571 (2014).
  3. Pak, J., Lee, J. H., Lee, S. H. Regenerative repair of damaged meniscus with autologous adipose tissue-derived stem cells. Biomed Res Int. 2014, 436029 (2014).
  4. Hocking, A. M. Mesenchymal Stem Cell Therapy for Cutaneous Wounds. Adv Wound Care. 1 (4), 166-171 (2012).
  5. Anthony, D. F., Shiels, P. G. Exploiting paracrine mechanisms of tissue regeneration to repair damaged organs. Transplant Res. 2 (1), 10 (2013).
  6. Teschendorff, A. E., et al. Epigenetic variability in cells of normal cytology is associated with the risk of future morphological transformation. Genome Med. 4 (3), 24 (2012).
  7. Liu, L., et al. Chromatin modifications as determinants of muscle stem cell quiescence and chronological aging. Cell Rep. 4 (1), 189-204 (2013).
  8. Bentivegna, A., et al. DNA Methylation Changes during In Vitro Propagation of Human Mesenchymal Stem Cells: Implications for Their Genomic Stability. Stem Cells Int. 2013, 192425 (2013).
  9. Bieback, K., Brinkmann, I. Mesenchymal stromal cells from human perinatal tissues: From biology to cell therapy. World J Stem Cells. 2 (4), 81-92 (2010).
  10. Tobita, M., Tajima, S., Mizuno, H. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and platelet-rich plasma: stem cell transplantation methods that enhance stemness. Stem Cell Res Ther. 6, 215 (2015).
  11. Kim, D. W., et al. Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells: phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  12. Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Stem cell paracrine actions and tissue regeneration. Regen Med. 5 (1), 121-143 (2010).
  13. Díaz-Prado, S., et al. Human amniotic membrane as an alternative source of stem cells. Differentiation. 1, 162-171 (2011).
  14. Puissant, B., et al. Immunomodulatory effect of human adipose tissue-derived adult stem cells: comparison with bone marrow mesenchymal stem cells. Br J Haematol. 129 (1), 118-129 (2005).
  15. Christodoulou, I., Kolisis, F. N., Papaevangeliou, D., Zoumpourlis, V. Comparative Evaluation of Human Mesenchymal Stem Cells of Fetal (Wharton’s Jelly) and Adult (Adipose Tissue) Origin during Prolonged In Vitro Expansion: Considerations for Cytotherapy. Stem Cells Int. 2013, 246134 (2013).
  16. Dalous, J., Larghero, J., Baud, O. Transplantation of umbilical cord-derived mesenchymal stem cells as a novel strategy to protect the central nervous system: technical aspects, preclinical studies, and clinical perspectives. Pediatr Res. 71 (4), 482-490 (2012).
  17. Escacena, N., Quesada-Hernandez, E., Capilla-Gonzalez, V., Soria, B., Hmadcha, A. Bottlenecks in the Efficient Use of Advanced Therapy Medicinal Products Based on Mesenchymal Stromal Cells. Stem Cells Int. 2015, (2015).
  18. Law, S., Chaudhuri, S. Mesenchymal stem cell and regenerative medicine: regeneration versus immunomodulatory challenges. Am J Stem Cells. 2 (1), 22-38 (2013).
  19. Brower, J., et al. Mesenchymal stem cell therapy and delivery systems in nonhealing wounds. Adv Skin Wound Care. 24 (11), 524-532 (2011).
  20. Angelos, M. G., Kaufman, D. S. Pluripotent stem cell applications for regenerative medicine. Curr Opin Organ Transplant. 20 (6), 663-670 (2015).
  21. Pera, M. F. Scientific considerations relating to the ethics of the use of human embryonic stem cells in research and medicine. Reprod Fertil Dev. 13 (1), 23-29 (2001).
  22. Espinoza, N., Peterson, M. How to depolarise the ethical debate over human embryonic stem cell research (and other ethical debates too). J Med Ethics. 38 (8), 496-500 (2012).
  23. Barrilleaux, B., Knoepfler, P. S. Inducing iPSCs to escape the dish. Cell Stem Cell. 9 (2), 103-111 (2011).
  24. Ding, D. C., Chang, Y. H., Shyu, W. C., Lin, S. Z. Human umbilical cord mesenchymal stem cells: a new era for stem cell therapy. Cell Transplant. 24 (3), 339-347 (2015).
  25. Jeschke, M. G., Gauglitz, G. G., Phan, T. T., Herndon, D. N., Kita, K. Umbilical Cord Lining Membrane and Wharton’s Jelly-Derived Mesenchymal Stem Cells: the Similarities and Differences. J Tissue Eng Regen Med. 4, 21-27 (2011).
  26. Oh, J., Lee, Y. D., Wagers, A. J. Stem cell aging: mechanisms, regulators and therapeutic opportunities. Nat Med. 20 (8), 870-880 (2014).
  27. Burkhalter, M. D., Rudolph, K. L., Sperka, T. Genome instability of ageing stem cells-Induction and defence mechanisms. Ageing Res Rev. 23, 29-36 (2015).
  28. Adams, P. D., Jasper, H., Rudolph, K. L. Aging-Induced Stem Cell Mutations as Drivers for Disease and Cancer. Cell Stem Cell. 16 (6), 601-612 (2015).
  29. Seshareddy, K., Troyer, D., Weiss, M. L. Method to isolate mesenchymal-like cells from Wharton’s Jelly of umbilical cord. Methods Cell Biol. 86, 101-119 (2008).
  30. Trivanovic, D., et al. Mesenchymal stem cells isolated from peripheral blood and umbilical cord Wharton’s jelly. Srp Arh Celok Lek. 141 (3-4), 178-186 (2013).
  31. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton’s jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726 (2013).
  32. Steigman, S. A., Fauza, D. O. Isolation of mesenchymal stem cells from amniotic fluid and placenta. Curr Protoc Stem Cell Biol. 1, (2007).
  33. Mennan, C., et al. Isolation and characterisation of mesenchymal stem cells from different regions of the human umbilical cord. Biomed Res Int. 2013, (2013).
  34. Conconi, M. T., Di Liddo, R., Tommasini, M., Calore, C., Parnigotto, P. P. Phenotype and differentiation potential of stem populations obtained from various zones of human umbilical cord-an overview. J Tissue Eng Regen Med. 4, 6-20 (2011).
  35. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  36. Weiss, M. L., et al. Human umbilical cord matrix stem cells: preliminary characterization and effect of transplantation in a rodent model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 24 (3), 781-792 (2006).
  37. Sarugaser, R., Lickorish, D., Baksh, D., Hosseini, M. M., Davies, J. E. Human umbilical cord perivascular (HUCPV) cells: a source of mesenchymal progenitors. Stem Cells. 23 (2), 220-229 (2005).
  38. Durnaoglu, S., Genc, S., Genc, K. Patient-specific pluripotent stem cells in neurological diseases. Stem Cells Int. 2011, 212487 (2011).
  39. Beeravolu, N., et al. Isolation and comparative analysis of potential stem/progenitor cells from different regions of human umbilical cord. Stem Cell Res. 16 (3), 696-711 (2016).
  40. Nekanti, U., et al. Long-term expansion and pluripotent marker array analysis of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 19 (1), 117-130 (2010).
  41. Nagamura-Inoue, T., He, H. Umbilical cord-derived mesenchymal stem cells: Their advantages and potential clinical utility. World J Stem Cells. 6 (2), 195-202 (2014).

Tags

Mesenchymal Stromal CellsUmbilical CordFetal PlacentaStem Cell BiologyAlternative MedicineMulti-potentCord Mesenchymal Stromal CellsAnatomical RegionsUmbilical CordWharton’s JellyEpitheliumSubamnionBlood VesselsPerivascular JellyTrypsinPartial Digestion

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Beeravolu, N., McKee, C., Alamri, A., Mikhael, S., Brown, C., Perez-Cruet, M., Chaudhry, G. R. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. J. Vis. Exp. (122), e55224, doi:10.3791/55224 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image