Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.
The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.
הריאות נמצאות בקשר רצוף עם הסביבה החיצונית ונחשפות מאוד לשני חלקיקים וחיידקים מזיקים עם היכולת לגרום למחלה. לכן, חשוב עבור מערכת החיסון לעלות תגובה חיסונית חזקה נגד פתוגנים פולשים, אך חשוב לא פחות לשמור על סובלנות לאנטיגנים בשאיפה כי אינו גורם למחלות. כדי לספק מעקב חיסוני חזק, מערכת הנשימה היא מצופית עם רשת של תאי מערכת חיסון, כוללים תאים דנדריטים (DCS). DCs הם תאים מקצועיים מציגי אנטיגן עם היכולת הייחודית להפעיל תאי T נאיביים. בריאות האדם, DCS תושב נתקלים אנטיגן ולאחר מכן תהליך ולהעביר אותה אל קשרי הלימפה לנקז-ריאה להגשה והפעלה של תאי T 1, 2, 3.
במערכת החיסון האנושית, DCS ניתן לחלק לכמה קבוצות משנה, עם distinct אבל פונקציות חופפות: CD1c + ו- CD141 + DCs מיאלואידית (MDCs) ו CD123 + DCs plasmacytoid (PDC) 4, 5. בעוד שרוב ידעתי מפורט על אדם DCs נובע ממחקרים בדם, עכשיו זה ברור כי ריאות אדם הנמל גם אוכלוסיות נדירות של תת DC עם קיבולת 6 גירוי תאי T, 7, 8, 9. עם זאת, הנתונים המצטברים מראים כי תאי חיסון, כולל DCS, נבדלים תדירות, פנוטיפ, ותפקודם בהתאם למיקום האנטומי שלהם 10. לכן, חשוב ללמוד תאים חיסוניים מן הרקמה הרלוונטית להבין תרומתם החסינה וסובלנות מקומיות. יחדיו, זה מדגיש את הצורך בלימוד DCS-תושב ריאות כאשר פונים מחלות ריאה, למרות DCs הדם להיות בקלות יותר זמין ונגיש בבני אדם.
המחקרים הראשונים שחקרו DCs תושב-ריאות בבני האדם הסתמכו בעיקר על מורפולוגיה הביטוי של סמנים יחידים, כגון HLA-DR ו CD11c, בסעיפי רקמות באמצעות אימונוהיסטוכימיה 11, 12, 13. לעומת זאת, מחקרים שנעשו לאחרונה יותר בדרך כלל יש לסמוך על תזרים cytometric מנתח ללמוד תת תא החיסון שונה. עם זאת, מאחר וקשה למצוא סמנו על פני קרום תא יחיד המזהה באופן ייחודי משנה DC ספציפי, ההגבלה הפוטנציאל של מחקרים החלימה רק בארבעת צבעים cytometry זרימה הוא הסיכון כולל אוכלוסיות תאים עם סמנים פנוטיפי דומים כמו DCs. לדוגמה, CD11c מתבטא בכל DCs מיאלואידית ואת הרוב המכריע של מונוציטים. מצד השני, במחקרי החלת לוחות cytometry זרימה מתקדמים יותר, רקמת ריאה שאינה סרטנית כריתות כירורגית של חולים בדרך כלל שמשהXref "> 10, 14, 15, 16, אם כי לא ברור אם האוכלוסיות הנדירות אלה הן מייצגים את חומר שבאמת נוכחי DCs בנבדקים בריאים. בסך הכל, מחקרים מוגבלים במידה רבה בשל העובדה כי בניתוח או רקמת ריאה אנושית כולו הוא נדיר.
כדי להתגבר על כמה מגבלות אלו, עבודה זו מתארת כיצד לבצע ניתוח מפורט של הפריסה המרחבית וכן זיהוי פנוטיפי של DCs בביופסיות endobronchial הרירית המתקבל מתנדבים בריאים שעברו ברונכוסקופיה. ביופסיות קטנות אחדות ניתן לאסוף כל פרט ולאחר מכן יכולות להיות מוטבעת עבור חתך וניתוח באמצעות אימונוהיסטוכימיה או מתעכלת enzymatically עבור ניתוח התזרים cytometric מתקדם. באמצעות רקמת הריאה בצורה של ביופסיות endobronchial המתקבל bronchoscopies מקנה יתרון של מה שהופך אותו ניתן לבצע את study על מתנדבים בריאים, בניגוד ניתוח פתוח של הריאות כי, מסיבות מובנות, הוא מוגבל לחולים הדורשים ניתוח חזה. יתר על כן, אותה הרקמה תדגם במהלך ברונכוסקופיה ממתנדבים בריאים נורמלית מבחינה פיזיולוגית, בניגוד אזור שאינו מושפע של רקמת ריאה בחולים עם מחלת ריאות. מצד השני, הביופסיות קטנות ומספר התאים להיאסף, גם כאשר איגום ביופסיות כמה, מגבילים את סוג הניתוחים שניתן לבצע.
בעוד העבודה הנוכחית מתמקדת DCS, השיטות שתוארו ניתן להרחיב ישירות לכלול אחרים (חיסוניים) תאים בעלי עניין הנמצאים ברקמת ריאה רירית אדם. יתר על כן, פרוטוקולים חלים גם ישירות דגימות שהתקבלו מחולים הסובלים ממחלות ריאות שבו ברונכוסקופיה היא חלק בהקמת האבחנה, כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD), סרקואידוזיס, או סרטן ריאות.
מאמר זה מתאר כיצד ליצור אפיון מרחבי phenotypical מפורט של DCs ריאות רקמות תושב בבני אדם בריא באמצעות אימונוהיסטוכימיה וזרימת cytometry על ביופסיות ברירית endobronchial שנאספו במהלך ברונכוסקופיה. בפסקאות הבאות צעדים קריטיים בפרוטוקול הם דנו בפירוט.
<p class="jove_step" style=";text-align:right;direction:rtl"…The authors have nothing to disclose.
המחברים מבקשים להודות למתנדבים שתרמו חומר קליני למחקר זה. אנחנו גם להודות מקרב לב לצוות במחלקה לבריאות הציבור ורפואה קלינית, המחלקה לרפואת רפואה / הנשימה, בית החולים האוניברסיטאי, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) לאיסוף כל החומר הקליני.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים AS-S ממועצת המחקר השוודי, קרן הלב-ריאות שוודית, קרן שוודית למחקרים אסטרטגיים, ואת קרולינסקה.
Bronchoscopy | |||
Bronchoscope BF1T160 | Olympus | BF1T160 | |
Light source | Olympus | Exera CV-160 | |
Fenestrated forceps | Olympus | FB21C | Used to take biopsies |
Bite Block | Conmed | 1429 | 20x27mm |
Glucose 25% | 500mL intravenous | ||
Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL | Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion | ||
Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o | Can be used for extra relaxation | ||
Lidocaine, 40mg/mL | Mouth and throat administration / Gargled | ||
Lidocaine 100mg/ml spray | Administered to back of throat | ||
Lidocaine 20mg/ml spray | Administered via bronchoscope to airways | ||
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
GMA processing and embedding | |||
Glass vials | 5mL | ||
Acetone | Sigma-Aldrich | 32201-1L | |
Molecular sieves, 4A | Alfa Aesar | 88120 | 3-4mm diameter pellets |
Phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma-Aldrich | P-7626 | 0.035g/100ml acetone |
Iodoacetamide | Sigma-Aldrich | I-6125 | 0.37g/100ml acetone |
Polythene-flat TAAB embedding capsules | TAAB laboratories | C094 | x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules |
Capsule holder | TAAB laboratories | C054 | Holds 25 8mm capsules |
JB-4 GMA embedding kit | Polysciences | 00226 | Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12) |
Methyl benzoate | Sigma-Aldrich | 27614-1L | |
Silica gel with humidity indicator | Scharlau | GE0043 | 2.5-6mm |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
GMA sectioning | |||
Glass microscope slides | ThermoFisher Scientific | 10143562CEF | Cut edges, frosted end |
Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920-500mL | 1:10 for working solution |
Sheet glass strips for ultramicrotomy | Alkar | ||
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | Wash solution (0.1% Tween20) |
LKB 7800B Knifemaker | LKB | ||
Capsule splitter | TAAB laboratories | C065 | |
Carbon steel single edge blades | TAAB laboratories | B054 | |
Vice | |||
Ammonia, 25% | VWR | 1133.1000 | 2mL in 1L, 1:500 (0.05%) |
Microtome | Leica | Leica RM 2165 | |
Light source | Leica | Leica CLS 150 XE | |
Microscope with swing arm stand | Leica | Leica MZ6 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
GMA Immunohistochemistry | |||
Diamond tipped pen | Histolab | 5218 | |
Hydrogen peroxide 30% solution | AnalaR Normapur | 23619.264 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | |
Tris | Roche | 10708976001 | |
Sodium chloride | VWR chemicals | 27810.295 | |
Bovine serum albumin | Millipore | 82-045-2 | Probumin BSA diagnostic grade |
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5546 | |
Anti-human CD45 antibody | BioLegend | 304002 | Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml |
Anti-human CD1a antibody | AbD Serotech | MCA80GA | Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml |
Mouse monoclonal IgG1 isotype control | Abcam | ab27479 | |
Mouse monoclonal IgG2a isotype control | Dako | X094301-2 | |
Vectastain ABC Elite standard kit | Vector Labs | PK-6100 | |
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite | Vector Labs | SK-4200 | |
Mayers haematoxylin | HistoLab | 01820 | |
Permanent Aqueous Mounting Medium | AbD Serotech | BUF058C | |
Drying oven | |||
DPX permanent mounting solution | VWR | 360292F | |
Light microscope | Leica | Leica DMLB | |
Microscope camera | Leica | Leica DFC 320 | |
Analysis software | Leica | Leica Qwin V3 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Enzymatic digestion | |||
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma-Aldrich | 55021C | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | DTT-RO | |
Collagenase II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
DNase | Sigma-Aldrich | 10104159001 ROCHE | |
RPMI 1640 | Sigma-Aldrich | R8758 | |
Forceps | |||
Platform rocker | Grant instruments | PMR-30 | |
50 mL conical tubes | Falcon | 14-432-22 | |
40 µm cell strainer | Falcon | 352340 | |
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Flow cytometry | |||
Phosphate Buffered Saline (PBS) | |||
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit | Life Technologies | L34957 | |
CD45 | BD | 555485 | |
CD3 | BD | 557757 | |
CD20 | BD | 335829 | |
CD56 | Biolegend | 318332 | |
CD66abce | Miltenyi | 130-101-132 | |
HLA-DR | BD | 555813 | |
CD14 | BD | 557831 | |
CD16 | Biolegend | 302026 | |
CD11c | BD | 560369 | |
CD1c | Miltenyi | 130-098-009 | |
CD141 | Miltenyi | 130-090-514 | |
CD103 | Biolegend | 350212 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | |
LSR II Flow cytometer | BD | Flow cytometer | |
FlowJo | FlowJo | Software for analysis |