Summary

Menschliche Lunge Dendritische Zellen: Räumliche Verteilung und phänotypische Identifizierung in Endobronchial Biopsien mittels Immunhistochemie und Durchflusszytometrie

Published: January 20, 2017
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Summary

Lung-resident immune cells, including dendritic cells (DCs) in humans, are critical for defense against inhaled pathogens and allergens. However, due to the scarcity of human lung tissue, studies are limited. This work presents protocols to process human mucosal endobronchial biopsies for studying lung DCs using immunohistochemistry and flow cytometry.

Abstract

The lungs are constantly exposed to the external environment, which in addition to harmless particles, also contains pathogens, allergens, and toxins. In order to maintain tolerance or to induce an immune response, the immune system must appropriately handle inhaled antigens. Lung dendritic cells (DCs) are essential in maintaining a delicate balance to initiate immunity when required without causing collateral damage to the lungs due to an exaggerated inflammatory response. While there is a detailed understanding of the phenotype and function of immune cells such as DCs in human blood, the knowledge of these cells in less accessible tissues, such as the lungs, is much more limited, since studies of human lung tissue samples, especially from healthy individuals, are scarce. This work presents a strategy to generate detailed spatial and phenotypic characterization of lung tissue resident DCs in healthy humans that undergo a bronchoscopy for the sampling of endobronchial biopsies. Several small biopsies can be collected from each individual and can be subsequently embedded for ultrafine sectioning or enzymatically digested for advanced flow cytometric analysis. The outlined protocols have been optimized to yield maximum information from small tissue samples that, under steady-state conditions, contain only a low frequency of DCs. While the present work focuses on DCs, the methods described can directly be expanded to include other (immune) cells of interest found in mucosal lung tissue. Furthermore, the protocols are also directly applicable to samples obtained from patients suffering from pulmonary diseases where bronchoscopy is part of establishing the diagnosis, such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD), sarcoidosis, or lung cancer.

Introduction

Die Lungen sind in ständigem Kontakt mit der äußeren Umgebung und sind an beiden unschädliche Teilchen und Mikroorganismen mit der Fähigkeit, Krankheit zu verursachen stark ausgesetzt. Daher ist es von entscheidender Bedeutung für das Immunsystem wirksamer Immunreaktionen gegen eindringende Pathogene zu montieren, aber es ist ebenso wichtig, Toleranz gegenüber inhalierten Antigenen zu erhalten, die nicht Krankheit verursachen kann. Bereitzustellen potent Immunüberwachung wird das Atmungssystem mit einem Netzwerk von Immunzellen ausgekleidet, einschließlich dendritischen Zellen (DCs). DCs sind professionelle Antigen-präsentierende Zellen, die mit der einzigartigen Fähigkeit naive T-Zellen zu aktivieren. In menschlichen Lungen auftreten resident DCs ein Antigen und dann verarbeiten und transportieren sie in die Lunge-drainierenden Lymphknoten zur Präsentation an und Aktivierung von T – Zellen 1, 2, 3.

Im menschlichen Immunsystem kann DCs in mehrere Untergruppen unterteilt werden, mit Distinct aber überlappende Funktionen: CD1c + und CD141 + myeloider DCs (MDC) und CD123 + plasmazytoiden DCs (PDCs) 4, 5. Während die meisten detailliertes Wissen über die menschliche DCs aus Studien in Blut stammt, ist nun klar , dass die menschliche Lunge 9 auch seltene Populationen von DC Untergruppen mit T-Zell – stimulierende Kapazität 6, 7, 8, Hafen. Allerdings zeigen anfallenden Daten , dass Immunzellen, einschließlich DCs, unterscheiden sich in ihrer Frequenz, Phänotyp und Funktion in Abhängigkeit von ihrer anatomischen Lage 10. Somit ist es wichtig, Immunzellen aus dem relevanten Gewebe zu studieren ihren Beitrag zur lokalen Immunität und Toleranz zu verstehen. Zusammengenommen unterstreicht dies die Notwendigkeit, Lungenresidenten DCs zu studieren, wenn Lungenerkrankungen Adressierung trotz Blut DCs mehr ist leicht verfügbar und zugänglich in Menschen.

Die ersten Studien , die Lungenresidenten DCs beim Menschen in erster Linie untersucht verließ sich auf die Morphologie und die Expression einzelner Marker, wie HLA-DR und CD11c, in Gewebeschnitten mittels Immunhistochemie 11, 12, 13. Im Gegensatz dazu haben neuere Studien der Regel auf durchflusszytometrischen verlassen analysiert verschiedene Immunzelluntergruppen zu untersuchen. Da es jedoch schwierig ist, einen einzelnen Zelloberflächenmarker zu finden, die eindeutig einen bestimmten DC Subset identifiziert, ist die potentielle Begrenzung der Studien Anwendung nur Vierfarben-Durchflusszytometrie das Risiko Zellpopulationen mit ähnlichen phänotypischen Marker wie DCs von einschließlich. Zum Beispiel CD11c wird auf allen myeloiden DCs und die überwiegende Mehrzahl der Monozyten exprimiert. Auf der anderen Seite, in Studien fortgeschritteneren Durchflusszytometrie Platten, nicht-kanzerösen Lungengewebe von chirurgische Resektionen von Patienten Anwendung wurden typischerweise verwendet,xref "> 10, 14, 15, 16, obwohl es ist unklar , ob diese seltenen Populationen von DCs in gesunden Probanden wirklich repräsentativ sind. Insgesamt sind im Wesentlichen auf die Tatsache Studien begrenzt , dass chirurgisch entfernt oder ganze menschliche Lungengewebe ist knapp.

Um einige dieser Einschränkungen zu überwinden, beschreibt diese Arbeit, wie eine detaillierte Analyse der räumlichen Verteilung und einer phänotypischen Identifizierung von DCs in der Schleimhaut endobronchiale Biopsien von gesunden Freiwilligen erhalten auszuführen, die eine Bronchoskopie unterziehen. Mehrere kleine Biopsien können von jedem einzelnen gesammelt werden und anschließend eingebettet werden kann für das Schneiden und Analyse Immunhistochemie oder enzymatisch für fortgeschrittene durchflusszytometrische Analyse verdaut. Verwendung von Lungengewebe in Form von endobronchialen Biopsien von Bronchoskopie erhalten verleiht den Vorteil, dass es möglich, die st auszuführenudy an gesunden Freiwilligen, im Gegensatz zu einer offenen Operation der Lunge, die aus offensichtlichen Gründen ist, beschränkt sich auf Patienten, die Thoraxchirurgie erfordern. Weiterhin das Gewebe, das während einer Bronchoskopie von gesunden Freiwilligen abgetastet ist physiologisch normal, im Gegensatz zu einem nicht-betroffenen Bereich von Lungengewebe bei Patienten mit einer Lungenkrankheit. Auf der anderen Seite sind die Biopsien klein und die Anzahl der Zellen wiedergewonnen, selbst wenn mehrere Biopsien Bündelung begrenzt den Typ von Analyse, die durchgeführt werden können.

Während die vorliegende Arbeit auf DCs konzentriert sich die beschriebenen Methoden direkt erweitert werden kann, um andere (Immun-) Zellen von Interesse, die in der menschlichen Schleimhaut Lungengewebe befinden umfassen. Darüber hinaus sind die Protokolle auch direkt anwendbar auf Proben von Patienten erhalten von Lungenerkrankungen leiden, wo Bronchoskopie Teil der Feststellung der Diagnose, wie zB chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD), Sarkoidose oder Lungenkrebs ist.

Protocol

HINWEIS: Diese Arbeit wurde von der regionalen Ethical Review Board in Umeå, Schweden genehmigt wurde. 1. Bronchoskopie zur Probenahme Endobronchial Biopsien von Human Subjects Erhalten Sie informierte Zustimmung aller Beteiligten. Behandeln Sie Patienten mit oralem Midazolam (4-8 mg) und intravenöse Glycopyrroniums (0,2-04 mg) 30 Minuten vor der Bronchoskopie. Bewerben Lokalanästhesie mit Lidocain in den Larynx und der Bronchien. Lassen Sie das Thema Gurgeln mit ~ 3 …

Representative Results

Studien an menschlichen Atmungsgewebe residenten Immunzellen zu charakterisieren, einschließlich DCs, sind begrenzt, vor allem aufgrund der Tatsache, dass chirurgisch entfernt oder ganze menschliche Lungengewebe ist knapp. Hier wird eine weniger invasive Methode der Lungengewebe von endobronchialen Biopsien erhalten (EBB) von gesunden Freiwilligen und entwickelten Protokolle, die Immunzellen in das Gewebe zu studieren Immunhistochemie unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder skizz…

Discussion

Dieses Dokument beschreibt, wie eine detaillierte räumliche und phänotypischen Charakterisierung von Lungengewebe residenten DCs bei gesunden Menschen zu erzeugen, Immunhistochemie und Zytometrie auf endobronchiale Schleimhaut-Biopsien während der Bronchoskopie gesammelt fließen. In den folgenden Absätzen kritischen Schritte in dem Protokoll werden im Detail diskutiert.

Kritische Schritte mit dem Protokoll

Schneiden und Immunhistochemie: Es ist wichtig, die Bio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren möchten die Freiwilligen danken, die klinische Material zu dieser Studie beigetragen haben. Wir sind auch dankbar, dass die Mitarbeiter an der Abteilung für öffentliche Gesundheit und klinische Medizin, Abteilung für Medizin / Pneumologie, Universitätsklinikum, Umeå (Norrlands universitetssjukhus) für die Sammlung aller klinischen Materials.

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse an AS-S von der schwedischen Research Council, die schwedische Herz-Lungen-Stiftung, der schwedischen Stiftung für strategische Forschung und dem Karolinska Institutet unterstützt.

Materials

Bronchoscopy
Bronchoscope BF1T160 Olympus BF1T160
Light source  Olympus Exera CV-160
Fenestrated forceps Olympus FB21C Used to take biopsies
Bite Block Conmed 1429 20x27mm
Glucose 25%  500mL intravenous
Glycopyrronium bromide 0.2mg/mL Intravenous. Prevents mucus/saliva secretion
Mixt. Midazolam 1mg/mL p.o Can be used for extra relaxation
Lidocaine, 40mg/mL Mouth and throat administration / Gargled
Lidocaine 100mg/ml spray Administered to back of throat
Lidocaine 20mg/ml spray Administered via bronchoscope to airways
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA processing and embedding
Glass vials 5mL
Acetone Sigma-Aldrich 32201-1L
Molecular sieves, 4A Alfa Aesar 88120 3-4mm diameter pellets
Phenylmethylsulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P-7626 0.035g/100ml acetone
Iodoacetamide Sigma-Aldrich I-6125 0.37g/100ml acetone
Polythene-flat  TAAB embedding capsules TAAB laboratories C094 x500 8mm diameter, polythene, flat-bottom capsules
Capsule holder TAAB laboratories C054 Holds 25 8mm capsules
JB-4 GMA embedding kit Polysciences 00226 Contains JB-4 Solution A (0026A-800), JB-4 solution B (0026B-3.8), benzoyl peroxide (02618-12)
Methyl benzoate Sigma-Aldrich 27614-1L
Silica gel with humidity indicator Scharlau GE0043 2.5-6mm 
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA sectioning
Glass microscope slides ThermoFisher Scientific 10143562CEF Cut edges, frosted end
Poly-L-Lysine solution Sigma-Aldrich P8920-500mL 1:10 for working solution
Sheet glass strips for ultramicrotomy Alkar
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287 Wash solution (0.1% Tween20)
LKB 7800B Knifemaker LKB
Capsule splitter TAAB laboratories C065
Carbon steel single edge blades TAAB laboratories B054
Vice
Ammonia, 25% VWR 1133.1000 2mL in 1L, 1:500 (0.05%)
Microtome Leica Leica RM 2165
Light source Leica Leica CLS 150 XE
Microscope with swing arm stand Leica Leica MZ6
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
GMA Immunohistochemistry
Diamond tipped pen Histolab 5218
Hydrogen peroxide 30% solution AnalaR Normapur 23619.264
Sodium azide Sigma-Aldrich S8032
Tris Roche 10708976001
Sodium chloride VWR chemicals 27810.295
Bovine serum albumin Millipore 82-045-2 Probumin BSA diagnostic grade
Dulbecco's modified eagle medium (DMEM) Sigma-Aldrich D5546
Anti-human CD45 antibody BioLegend 304002 Mouse monoclonal, clone HI30, isotype IgG1k. Working concentration of 500 ng/ml
Anti-human CD1a antibody AbD Serotech MCA80GA Mouse monoclonal, clone NA1/34-HLK, isotype IgG2a. Working concentration of 10 µg/ml
Mouse monoclonal IgG1 isotype control Abcam ab27479
Mouse monoclonal IgG2a isotype control Dako X094301-2
Vectastain ABC Elite standard kit Vector Labs PK-6100
AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) peroxidase substrate kite Vector Labs SK-4200
Mayers haematoxylin HistoLab 01820
Permanent Aqueous Mounting Medium AbD Serotech BUF058C
Drying oven
DPX permanent mounting solution  VWR 360292F
Light microscope Leica Leica DMLB
Microscope camera Leica Leica DFC 320
Analysis software Leica Leica Qwin V3
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Enzymatic digestion
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma-Aldrich 55021C
Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich DTT-RO
Collagenase II Sigma-Aldrich C6885
DNase Sigma-Aldrich 10104159001 ROCHE
RPMI 1640 Sigma-Aldrich R8758
Forceps
Platform rocker Grant instruments PMR-30
50 mL conical tubes Falcon 14-432-22
40 µm cell strainer Falcon 352340
Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Flow cytometry
Phosphate Buffered Saline (PBS)
LIVE/DEAD Aqua fixable dead cell stain kit Life Technologies L34957
CD45 BD 555485
CD3 BD 557757
CD20 BD 335829
CD56 Biolegend 318332
CD66abce Miltenyi 130-101-132
HLA-DR BD 555813
CD14 BD 557831
CD16 Biolegend 302026
CD11c BD 560369
CD1c Miltenyi 130-098-009
CD141 Miltenyi 130-090-514
CD103 Biolegend 350212
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich F8775
LSR II Flow cytometer BD Flow cytometer
FlowJo FlowJo Software for analysis

References

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Baharom, F., Rankin, G., Scholz, S., Pourazar, J., Ahlm, C., Blomberg, A., Smed-Sörensen, A. Human Lung Dendritic Cells: Spatial Distribution and Phenotypic Identification in Endobronchial Biopsies Using Immunohistochemistry and Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (119), e55222, doi:10.3791/55222 (2017).

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