Doğum sonrası kardiyomiyositlerde Hücre Döngüsü Varyasyonları görselleştirme ve Çekirdeklenme Belirlenmesi
Summary
To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.
Abstract
Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.
Introduction
kardiyomiyosit çekirdekleri ve hücre döngüsü durumu doğru tespiti kalp kası ciro ve yenilenme belirlenmesi için büyük önem taşımaktadır. Bu hücre siklusunu tanımlamak için bu tür pHH3, Ki-67, ya da Timidin analogları gibi, nükleer belirteçleri, kullanımı için de geçerlidir. Erişkin memeli kardiyomiyositlerinin proliferatif kapasitesi 1, bir çoğalma tahlilinde sonucu önemli bir fark olabilir bir kardiyomyosit çekirdeğin proliferasyon belirteci için pozitif bir çekirdeğin bir sahte kimlik, çok küçük olduğu için. Ayrıca, kardiyomiyositlerde poliploid ve çok çekirdekli hücrelerde yerine hücre bölünmesi sonucu bu endoreduplication ve acytokinetic mitoz hücre döngüsünde varyasyonları, yatkındır. Bu amaçla, genel hücre döngüsü belirteçleri karşı antikor boyama yorumlanması her durumda kesin değildir.
Burada, biz düz forwa için yöntemler mevcut rd fare kardiyomiyositlerinin tanınması ve bunların çekirdeklerin kesin tanımlanması ile doğum sonrası ve yetişkin aşamalarında yerli izole hücreler ve kalın doku kesitlerinde onların nuclearity. Bu amaçla, Myh6 promoteri (Myh6-H2B-MCH) kontrolü altında insan histon H2B ve mCherry oluşan bir füzyon proteininin kardiyomiyosit spesifik ifadesi ile bir transgenik fare hattı 2 kullanıldı. Bir EGFP-anillin füzyon proteinin ekspresyonu, bir CMV artırıcı ile yerde tavuk aktin promoterinin kontrolü altında olduğu bir transgenik proliferasyon göstergesi fare hattı ile fare hattı, çapraz yetiştirme (CAG-EGFP-anillin) sağlar hücre döngüsü durumunun belirlenmesi. Iskeleler proteini anillin özel olarak etkin olan hücreler 3 hücre döngüsü olarak ifade edilir ve hücre döngüsü sırasında ayırıcı hücre içi lokalizasyonu M faz yüksek çözünürlüğe sahip canlı izleme hücre döngüsü ilerlemesi sağlarEF "> 4. Bu nedenle, çift transgenik fareler çoğalan kardiyomiyositlerde ve hücre döngüsü şekilde değişikliklere uğrar olanlar arasında ayrım yapmak için kullanılabilir. Bu, in vitro proliferasyon uyaran maddelerin taranmasında özellikle faydalı olduğu ortaya çıkmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
kardiyomiyositlerde hücre döngüsünü tekrar girin ve yaralanma sonrası ve doku homeostazında sırasında bölmek mümkün olmadığı üzerinde bir tartışma vardır. Kardiyomiyositlerinin temel ciro değerleri% 1 1 ve% 80 7 aralığında verilmiştir. % 40 – 7 da kardiyak lezyon sonrası, hücre döngüsü aktivitesinin indüksiyonu ve yeni kardiyomiyositlerde üretimi 0.0083,% 8 ve 25 arasında değerler ile, sınır…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank S. Grünberg (Bonn, Germany) and P. Freitag (Bonn, Germany) for their technical assistance.
Materials
| 10 cm petri dish | Sarstedt | 821472 | |
| 100 µm cell strainer | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| G20x1 ½ injection cannula, Sterican | Braun, Melsungen | 4657519 | |
| 20 gauge needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
| 24-well plates | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
| 2-Methyl-butane | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
| 37% formaldehyde solution | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
| 3-way stopcock | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
| 50 ml syringe | B. Braun Medical Inc. | 8728810F | |
| 70% ethanol | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
| Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-605-205 | |
| Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG | Sigma-Aldrich, Steinheim | A7811 | |
| CaCl | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area | Greiner bio-one | 675986 | |
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | |
| confocal microscope Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| cryostat CM 3050S | Leica | ||
| donkey serum | Jackson Immuno Research, Suffolk, GB | 017-000-121 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| fetal calf serum | PromoCell, Heidelberg | ||
| Formaldehyde solution (4%) | PanReac AppliChem | A3697 | |
| Gelatine from porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich, Steinheim | G2500 | |
| glass coverslips | VWR | 631-0146 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Heidelberger extension tube | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HistoBond microscope slides | Marienfeld | 0810000 | |
| Hoechst 33342 (1mg/ml) | Sigma Aldrich, Taufkirchen | B2261 | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
| Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 21980-032 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | Corning | 354221 | |
| Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | 13778075 | |
| Mouse IgG Cy5 (donkey) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | |
| MGCl | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| microcentrifuge tube | Sarstedt | 72690 | |
| Mini shaker | VWR | 12620-940 | |
| mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4464066 | |
| Biopsy Mold | Sakura Finetek/ VWR | 4565 | |
| M-slide 8-well ibiTreat | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Merck Millipore | 567530 | |
| negative control(scrambled RNA) | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach | 130-098-373 | |
| NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Non essential amino acids, NEAA | Gibco/Life Technologies, Darmstad | 11140-035 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco | 51985-026 | |
| P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Steinheim | 14190-094 | |
| Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading | Sigma-Aldrich | 10981 | |
| RNase A | Qiagen | 1007885 | |
| RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | AM9780 | |
| sample containers | Vitlab | 80731 | |
| Serological pipette | Greiner | 607180 | |
| software NIS Elements | Nikon | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek/ VWR | 25608-930 | |
| ToPro3 iodide (642/661) | Molecular probes/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X | Fluka | 93418 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| Wheat germ agglutinine (WGA) Fluorescein labeled | Vector Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
| α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Steinheim | M3148 |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
- Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
- Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
- Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
- Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
