Визуализация клеточного цикла вариаций и определение нуклеации в послеродовом кардиомиоцитов
Summary
To distinguish cell division from cell cycle variations in cardiomyocytes, we present protocols using two transgenic mouse lines: Myh6-H2B-mCh transgenic mice, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and CAG-eGFP-anillin mice, for distinguishing cell division from cell cycle variations.
Abstract
Cardiomyocytes are prone to variations of the cell cycle, such as endoreduplication (continuing rounds of DNA synthesis without karyokinesis and cytokinesis) and acytokinetic mitosis (karyokinesis but no cytokinesis). Such atypical cell cycle variations result in polyploid and multinucleated cells rather than in cell division. Therefore, to determine cardiac turnover and regeneration, it is of crucial importance to correctly identify cardiomyocyte nuclei, the number of nuclei per cell, and their cell cycle status. This is especially true for the use of nuclear markers for identifying cell cycle activity, such as thymidine analogues Ki-67, PCNA, or pHH3. Here, we present methods for recognizing cardiomyocytes and their nuclearity and for determining their cell cycle activity. We use two published transgenic systems: the Myh6-H2B-mCh transgenic mouse line, for the unequivocal identification of cardiomyocyte nuclei, and the CAG-eGFP-anillin mouse line, for distinguishing cell division from cell cycle variations. Combined together, these two systems ease the study of cardiac regeneration and plasticity.
Introduction
Правильная идентификация ядер кардиомиоцитов и состояния клеточного цикла имеет решающее значение для определения сердечного оборота мышц и регенерации. Это особенно верно для использования ядерных маркеров, таких как pHH3, Ki-67, или аналоги тимидина, для идентификации клеточного цикла активности. По мере того как пролиферативную способность взрослых кардиомиоцитов млекопитающих очень мала 1, ложная идентификация ядра положительного для маркера пролиферации ядра кардиомиоцитов может внести существенное различие в результатах анализе пролиферации. Кроме того, кардиомиоциты склонны к изменениям клеточного цикла, такие как эндоредупликации и acytokinetic митоза, которые приводят к полиплоидных и многоядерные клетки, а не в делении клеток. С этой целью, интерпретация меченых антител против маркеров общего клеточного цикла не является окончательным во всех случаях.
Здесь мы представляем методы прямой-forwa й признание кардиомиоцитов мышей и их ядерность в родных изолированных клеток и участков толстой ткани на послеродовом и взрослых этапах путем однозначной идентификации их ядер. Для этой цели, трансгенной линии мышей с кардиомиоциты экспрессией слитого белка , состоящего из Н2В человеческого гистона и mCherry под контролем промотора Myh6 (Myh6-Н2В-MCH) использовали 2. Скрещивание этой мыши линии с трансгенной индикатором пролиферации линии мыши, в которой экспрессия слитого белка EGFP-anillin находится под контролем повсеместной курица актина с CMV энхансер (CAG-EGFP-anillin), допускает определение статуса клеточного цикла. Подмости белок anillin специфически экспрессируется в клеточном цикле активных клеток 3, а его дифференциал субклеточном локализации во время клеточного цикла позволяет прогрессии клеточного цикла живого слежения с высоким разрешением M-фазыЭФ "> 4. Таким образом, двойной трансгенные мыши могут быть использованы для различения между пролиферирующих кардиомиоцитов и те , которые претерпевают изменения клеточного цикла. Это доказывает , особенно полезным при скрининге пролиферации индуцирующих веществ в пробирке.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует спор по поводу того, кардиомиоциты способны повторно клеточный цикл и разделить после травмы и в течение гомеостаза тканей. Значения для основного оборота кардиомиоцитов были даны в диапазоне от 1% до 1 и 80% 7. Кроме того, после повреждения сердца, инд?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank S. Grünberg (Bonn, Germany) and P. Freitag (Bonn, Germany) for their technical assistance.
Materials
| 10 cm petri dish | Sarstedt | 821472 | |
| 100 µm cell strainer | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 352360 | |
| 2,3-Butanedione monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| G20x1 ½ injection cannula, Sterican | Braun, Melsungen | 4657519 | |
| 20 gauge needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | |
| 24-well plates | Becton Dickinson GmbH/Falcon | 353047 | |
| 2-Methyl-butane | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3927.1 | |
| 37% formaldehyde solution | AppliChem GmbH | A0936,1000 | |
| 3-way stopcock | B. Braun Medical Inc. | 16494C | |
| 50 ml syringe | B. Braun Medical Inc. | 8728810F | |
| 70% ethanol | Otto Fischar GmbH | 27669 | |
| Alexa-Fluor-conjugated secondary antibody | Jackson ImmunoResearch | 115-605-205 | |
| Alpha-Aktinin EA-53, Mouse IgG | Sigma-Aldrich, Steinheim | A7811 | |
| CaCl | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell Culture Microplate, 96 Well, Half Area | Greiner bio-one | 675986 | |
| Collagenase B | Roche | 11088815001 | |
| confocal microscope Eclipse Ti-E | Nikon | ||
| cryostat CM 3050S | Leica | ||
| donkey serum | Jackson Immuno Research, Suffolk, GB | 017-000-121 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E4884 | |
| fetal calf serum | PromoCell, Heidelberg | ||
| Formaldehyde solution (4%) | PanReac AppliChem | A3697 | |
| Gelatine from porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich, Steinheim | G2500 | |
| glass coverslips | VWR | 631-0146 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Heidelberger extension tube | IMPROMEDIFORM GmbH | MF 1833 | |
| Heparin-Natrium | Ratiopharm | 5394.02.00 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| HistoBond microscope slides | Marienfeld | 0810000 | |
| Hoechst 33342 (1mg/ml) | Sigma Aldrich, Taufkirchen | B2261 | |
| Insulin syringe | Becton Dickinson GmbH | 300334 | |
| Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium (IMDM) | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 21980-032 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | Corning | 354221 | |
| Laser Scanning Mikroskop Eclipse Ti | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | 13778075 | |
| Mouse IgG Cy5 (donkey) | Jackson ImmunoResearch | 715-175-151 | |
| MGCl | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| microcentrifuge tube | Sarstedt | 72690 | |
| Mini shaker | VWR | 12620-940 | |
| mirVana miRNA mimic, hsa-miR199a-3p | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4464066 | |
| Biopsy Mold | Sakura Finetek/ VWR | 4565 | |
| M-slide 8-well ibiTreat | ibidi | 80826 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaOH | Merck Millipore | 567530 | |
| negative control(scrambled RNA) | Ambion/Thermo Fischer Scientific | AM4611 | |
| Neonatal Heart Dissociation Kit | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach | 130-098-373 | |
| NIS Elements AR 4.12.01-4.30.02-64bit | Nikoninstruments, Düsseldorf | ||
| Non essential amino acids, NEAA | Gibco/Life Technologies, Darmstad | 11140-035 | |
| Opti-MEM, Reduced Serum Medium | Gibco | 51985-026 | |
| P21-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| P27-siRNA | Ambion/Thermo Fischer Scientific | 4390771 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco/Life Technologies, Darmstadt | 15140-122 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Steinheim | 14190-094 | |
| Polyvinyl alcohol mounting medium with DABCO®, antifading | Sigma-Aldrich | 10981 | |
| RNase A | Qiagen | 1007885 | |
| RNaseZap | Invitrogen/Life Technologies, Darmstadt | AM9780 | |
| sample containers | Vitlab | 80731 | |
| Serological pipette | Greiner | 607180 | |
| software NIS Elements | Nikon | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek/ VWR | 25608-930 | |
| ToPro3 iodide (642/661) | Molecular probes/ThermoFisher Scientific | T3605 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X | Fluka | 93418 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93418 | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| Wheat germ agglutinine (WGA) Fluorescein labeled | Vector Laboratories | VEC-FL-1021-5 | |
| α-actinin antibody | Sigma-Aldrich | A7811 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich, Steinheim | M3148 |
References
- Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
- Raulf, A., et al. Transgenic systems for unequivocal identification of cardiac myocyte nuclei and analysis of cardiomyocyte cell cycle status. Basic Res.Cardiol. 110 (3), 33 (2015).
- Field, C. M., Alberts, B. M. Anillin, a contractile ring protein that cycles from the nucleus to the cell cortex. J.Cell Biol. 131 (1), 165-178 (1995).
- Hesse, M., et al. Direct visualization of cell division using high-resolution imaging of M-phase of the cell cycle. Nat.Commun. 3, 1076 (2012).
- Eulalio, A., et al. Functional screening identifies miRNAs inducing cardiac regeneration. Nature. 492 (7429), 376-381 (2012).
- Di, S. V., Giacca, M., Capogrossi, M. C., Crescenzi, M., Martelli, F. Knockdown of cyclin-dependent kinase inhibitors induces cardiomyocyte re-entry in the cell cycle. J.Biol.Chem. 286 (10), 8644-8654 (2011).
- Hosoda, T., et al. Clonality of mouse and human cardiomyogenesis in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 106 (40), 17169-17174 (2009).
- Soonpaa, M. H., Field, L. J. Assessment of cardiomyocyte DNA synthesis in normal and injured adult mouse hearts. Am.J.Physiol. 272 (1 Pt 2), H220-H226 (1997).
- Ang, K. L., et al. Limitations of conventional approaches to identify myocyte nuclei in histologic sections of the heart. Am.J.Physiol Cell Physiol. 298 (6), C1603-C1609 (2010).
- Engel, F. B., Schebesta, M., Keating, M. T. Anillin localization defect in cardiomyocyte binucleation. J Mol Cell Cardiol. 41 (4), 601-612 (2006).
- Bergmann, O., et al. Dynamics of Cell Generation and Turnover in the Human Heart. Cell. 161 (7), 1566-1575 (2015).
