Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

cribado de alto rendimiento (HTS) es una estrategia probada ampliamente adoptado para la identificación de nuevas moléculas terapéuticas o para el reposicionamiento de fármacos aprobados por la FDA en nuevas indicaciones médicas. ¹ Hasta ahora, el éxito alcanzado HTS se puede medir por la gran cantidad de medicamentos descubiertos con anterioridad. Por ejemplo, el inhibidor de tirosina quinasa lapatinib utiliza para el tratamiento de cáncer de mama, la sitagliptina; una dipeptidil peptidasa-4 (DPP-4) inhibidor utilizado como un fármaco anti-hiperglucémico, y el dasatinib por vía oral inhibidor de la tirosina quinasa Bcr-Abl se utiliza para el tratamiento de la leucemia mielógena crónica representan algunos ejemplos de una larga lista de medicamentos aprobados originalmente descubierto por HTS. ² Aunque la productividad de la industria farmacéutica ha sufrido últimamente de una falta en el descubrimiento de nuevas entidades químicas, la probabilidad de descubrimiento de fármacos con éxito se puede mejorar a través de un aumento en el número de candida pre-clínicates que exhiben propiedades biológicas / bioquímicas moduladores. En consecuencia, el desarrollo de nuevos ensayos de HTS adaptados para el cribado fenotípico podría ofrecer el potencial de proporcionar importantes herramientas farmacológicas para el descubrimiento de nuevos éxitos de drogas. ^{3, 4, 5, 6} Además, HTS ahora pueden llevarse a cabo a un ritmo más rápido debido a las transformaciones tecnológicas importantes en los últimos años, incluyendo instalaciones de diseño personalizado flexibles, nuevas tecnologías robóticas Lectura y extensa miniaturización. ^{2, 7} Entre los factores que contribuyen a la creciente interés en el uso de la detección fenotípica (aka hacia adelante farmacología) es la percepción de que se centra en los efectos funcionales en lugar de supuestos reduccionistas simplistas con respecto a dianas moleculares (detección / reacciones bioquímicas por objetivos) es más probable sho eficacia clínica w. Por lo tanto, el cribado fenotípico mantiene la promesa de descubrir nuevos compuestos potencialmente terapéuticos y vías moleculares de las enfermedades actualmente incurables. ²

Para identificar correctamente inhibidores o activadores para una diana molecular dada o la función celular, se requiere un ensayo altamente sensible y fiable con el fin de diferenciar entre los accesos de buena fe y falsos positivos. Por lo tanto, lo que hace un buen ensayo? La calidad de un ensayo dado debe ser primero juzgado por la relación de señal a ruido (que se refleja a través de un factor Z). ⁸ En segundo lugar, el efecto específico o el objetivo de la pantalla deben estar claramente establecidas. Por ejemplo, los enfoques basados ​​en células funcionales pueden ofrecer ventajas significativas para la detección del receptor en lugar de un ensayo diseñado específicamente para evaluar la unión del ligando-receptor. La razón de esto es que el último enfoque no puede diferenciar entre ligandos agonistas y antagonistas.ss = "xref"> 9 En contraste, un enfoque basado en la célula es probable que sea más eficaz como la función del receptor puede ser evaluada directamente en un fenotipo biológico (proliferación, la detención del ciclo celular, apoptosis, y / o diferenciación). Sin embargo, hay que señalar que los ensayos bioquímicos pueden proporcionar ventajas significativas sobre ensayos fenotípicos, ya que infringen una diana intracelular específica. Un ensayo bioquímico bien optimizado en general, tendrá menos dispersión de datos que un cribado fenotípico al tiempo que simplifica posteriormente las investigaciones relacionadas con el mecanismo molecular de acción de drogas. Sin embargo, el principal inconveniente de los ensayos basados ​​en diana o bioquímicos es la posibilidad de amplificar la tasa de falsos positivos hits que pueden afectar a los objetivos no específicos cuando se prueba en un sistema biológico (pérdida de la especificidad estudiado originalmente en el ensayo bioquímico). ¹⁰ Aunque un punto de corte bien establecida entre los accesos negativos y positivos puede minimizar el número de falsos positivos in el cribado primario, el uso de un sistema fisiológicamente relevante imitando el ambiente celular nativo, como células intactas, todo el tejido o animal conjunto sigue siendo el núcleo del péndulo diseño de ensayo. Por lo tanto, el cribado fenotípico permite el descubrimiento de cabezas con efectos fenotípicos biológicos / deseables para las enfermedades que no tienen objetivos de medicamentos identificados sin tener conocimiento previo de la actividad o modo de acción del compuesto. ¹¹

El estudio en el presente documento se refiere al desarrollo y ensayo de un cribado fenotípico optimizado y reproducible basado en dos componentes importantes: un modelo de ratón comercialmente disponible y un clúster sub-familia de compuestos químicos. Con respecto al modelo animal, el ensayo se basa en el uso de los linfocitos derivados de una cepa de ratón (Nur77 ^GFP) que alberga un cromosoma artificial bacteriano que contiene un casete en el que la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP) es conducido por THpromotor e Nur77. ¹² La característica distintiva de esta estimulación se basa en el hecho de que Nur77 es un gen temprano inmediato hasta reguladas siguiente receptor de células T (TCR) o la estimulación del receptor de células B (BCR). ¹² En cuanto al método de detección en sí, se utilizó un enfoque para ayudar a evitar la detección de análogos triviales y reducir al mínimo el tiempo necesario para evaluar una gran biblioteca química (> 10 ⁵ compuestos). Para ello, una base de datos de compuestos químicos seleccionados por los químicos medicinales que utilizan herramientas de cribado virtual fue explotada para identificar compuestos topológicamente similares utilizando estructuras de semillas activas conocidas como referencias. Este enfoque nos ha permitido a la pantalla de 4.398 compuestos que representan una biblioteca global de más de 136.000 entidades químicas.