A Fluorescência baseada em Linfócitos ensaio adequado para high-throughput screening de pequenas moléculas

High Throughput Screening (HTS) é uma estratégia comprovada amplamente adoptada para a identificação de novas moléculas terapêuticas ou para o reposicionamento de drogas aprovadas pela FDA em novas indicações médicas. ¹ Até agora, o sucesso conseguido HTS pode ser medido pela pletora de drogas anteriormente descobertos. Por exemplo, a lapatinib inibidor de tirosina cinase utilizado para o tratamento de cancro da mama, sitagliptina; uma dipeptidil-peptidase-4 (DPP-4) inibidor utilizado como uma droga anti-hiperglicémicos, e o dasatinib inibidor de tirosina quinase Bcr-Abl oral utilizado para o tratamento de leucemia mielóide crónica representam alguns exemplos de uma longa lista de drogas aprovadas originalmente descobertas pela HTS. ² Embora a produtividade da indústria farmacêutica ultimamente tem sofrido com a falta na descoberta de novas entidades químicas, a probabilidade de sucesso da descoberta de drogas podem ser melhorados através de um aumento no número de Candida pré-clínicates que apresentam propriedades biológicas / bioquímicas moduladores. Por conseguinte, o desenvolvimento de novos ensaios HTS adaptados para o rastreio fenotípica pode oferecer o potencial para proporcionar ferramentas farmacológicas importantes para a descoberta de novas drogas visitas. ^{3, 4, 5, 6} Além disso, HTS agora podem ser realizadas em um ritmo mais rápido devido às transformações tecnológicas significativas nos últimos anos, incluindo instalações de design personalizado flexíveis de robótica, novas tecnologias de leitura e do extenso miniaturização. ^{2, 7} Entre os fatores que contribuem para o crescente interesse no uso de triagem fenotípica (aka frente farmacologia) é a percepção de que o foco em efeitos funcionais, em vez de pressupostos reducionistas simplistas sobre alvos moleculares (/ reações bioquímicas de triagem por objectivo) é mais provável ao sho W eficácia clínica. Assim, a seleção fenotípica mantém a promessa de descobrir novos compostos potencialmente terapêuticos e vias moleculares de doenças atualmente incuráveis. ²

Para identificar correctamente inibidores ou activadores para um determinado alvo molecular ou função celular, um ensaio altamente sensível e fiável é necessária, a fim de diferenciar entre visitas de bona fide e falsos positivos. Então, o que faz um bom ensaio? A qualidade de um dado ensaio deve ser primeiro julgado por a relação sinal-ruído (reflectida por meio de um factor de Z). ⁸ Em segundo lugar, o efeito alvejado ou a meta da tela deve ser claramente estabelecida. Por exemplo, as abordagens baseadas em células funcionais podem oferecer vantagens significativas para o rastreio do receptor, em oposição a um ensaio especificamente concebido para avaliar o ligando-receptor de ligação. A razão para isto é que a última abordagem não é possível diferenciar entre ligandos agonistas e antagonistas.SS = "refex"> 9 Em contraste, uma abordagem baseada na célula é provável que seja mais eficaz como função do receptor pode ser avaliada directamente num fenótipo biológico (proliferação, a paragem do ciclo celular, apoptose, e / ou diferenciação). No entanto, deve notar-se que os ensaios bioquímicos pode proporcionar vantagens significativas sobre ensaios fenotípicos como eles infringir um alvo intracelular específico. Um ensaio bioquímico bem otimizado geralmente têm menos dispersão de dados do que uma triagem fenotípica, simplificando posteriormente investigações relacionadas com o mecanismo molecular de drogas de ação. No entanto, o grande inconveniente de ensaios baseados em alvo ou bioquímicos, é a possibilidade de amplificar a taxa de visitas de falsos positivos que possam afectar alvos não-específicas, quando testado num sistema biológico (perda da especificidade originalmente estudada no ensaio bioquímico). ¹⁰ Apesar de um ponto de corte bem estabelecida entre hits negativos e positivos podem minimizar o número de falsos positivos in a despistagem primária, a utilização de um sistema fisiologicamente relevante imitando o ambiente celular nativo, tais como células intactas, tecido ou animal inteiro todo permanece o núcleo do pêndulo desenhos de ensaios. Portanto, a seleção fenotípica permite a descoberta liderança com efeitos fenotípicos biológicas / desejáveis ​​para doenças sem drogas metas identificados sem ter conhecimento prévio da actividade do composto ou modo de ação. ¹¹

O presente estudo refere-se ao desenvolvimento e teste de uma seleção fenotípica optimizada e reprodutível com base em dois componentes importantes: um modelo de rato disponível no mercado e uma sub-família agrupado de compostos químicos. No que diz respeito ao modelo animal, o ensaio baseia-se na utilização de linfócitos derivados de uma estirpe de ratinho (Nur77 ^GFP) que alberga um cromossoma artificial bacteriano que contém uma cassete em que a expressão da proteína fluorescente verde (GFP) é accionado por Thpromotor e Nur77. ¹² A principal característica de esta estimulação é baseado no facto de que Nur77 é um gene precoce imediato sobre-regulada na sequência do receptor de células T (TCR) ou a estimulação do receptor de células B (BCR). ¹² Como para o próprio método de rastreio, uma abordagem foi utilizada para ajudar a evitar o rastreio de análogos de triviais, minimizando o tempo necessário para avaliar uma biblioteca de química (> 10 ⁵ compostos). Para isso, um banco de dados de compostos químicos selecionados por medicamentos químicos usando ferramentas Virtual foi explorada para identificar compostos topologicamente semelhantes usando estruturas de sementes ativos conhecidos como referências. Esta abordagem permitiu-nos para a tela 4.398 compostos representam uma biblioteca global de mais de 136.000 entidades químicas.