ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة
Summary
نقدم في الدراسة الحالية مقايسة على أساس مضان رواية باستخدام الخلايا الليمفاوية المستمدة من الفئران المحورة جينيا. هذا الاختبار هو مناسبة لفحص عالية الإنتاجية (HTS) من جزيئات صغيرة هبوا قدرة أي عرقلة أو تعزيز تنشيط الخلايا اللمفاوية.
Abstract
فحص عالية الإنتاجية (HTS) هو حاليا الدعامة الأساسية لتحديد الكيانات الكيميائية القادرة على تحوير التفاعلات الكيميائية الحيوية أو العمليات الخلوية. مع تقدم التكنولوجيا الحيوية والقدرة متعدية عالية من جزيئات صغيرة، تطورت عدد من الأساليب المبتكرة في اكتشاف المخدرات، وهو ما يفسر اهتمام طالبان في استخدام HTS. مجال علم الأورام ويعمل حاليا في مجال البحوث الأكثر نشاطا لفحص المخدرات، مع عدم وجود تقدم كبير جعل لتحديد المركبات المناعية جديدة تستهدف مضاعفات زرع أو أمراض المناعة الذاتية. هنا، نقدم رواية في المختبر الفئران أساس فلوري فحص الخلايا اللمفاوية تتكيف بسهولة لتحديد المركبات المناعية جديدة. يستخدم هذا الاختبار T أو B الخلايا المشتقة من الفئران المحورة جينيا، التي المروج Nur77 يدفع التعبير GFP على تي أو B-خلية تحفيز مستقبلات. كما تعكس كثافة GFP لتفعيل / النشاط النسخي للخلية المستهدفة، ويعرف لدينا فحص أداة جديدة لدراسة تأثير مركب معين (ق) على الاستجابات الخلوية / البيولوجية. على سبيل المثال، تم إجراء فحص أساسي باستخدام 4398 مركبات في ظل عدم وجود "فرضية الهدف"، والتي أدت إلى تحديد 160 الزيارات المحتملة عرض الأنشطة المناعية. وهكذا، فإن استخدام هذا الاختبار هو مناسبة لبرامج اكتشاف المخدرات استكشاف مكتبات كيميائية كبيرة قبل لزيادة في المختبر / في الدراسات المجراة التحقق من الصحة.
Introduction
فحص عالية الإنتاجية (HTS) هو استراتيجية مؤكدة اعتمدت على نطاق واسع لتحديد جزيئات علاجية جديدة أو لإعادة تنظيم الأدوية وافقت عليها الهيئة في مؤشرات طبية جديدة. 1 وحتى الآن، فإن نجاح HTS حققت يمكن قياسها من قبل عدد كبير من الأدوية المكتشفة سابقا. على سبيل المثال، استخدام المانع lapatinib التيروزين كيناز لعلاج سرطان الثدي، سيتاقلبتين. تمثل dipeptidyl ببتيداز-4 (DPP-4) المانع تستخدم العقاقير المضادة للفرط سكر الدم، والفم BCR-المحمول جوا التيروزين كيناز المانع dasatinib المستخدمة لعلاج سرطان الدم النقوي المزمن أمثلة قليلة من قائمة طويلة من الأدوية المعتمدة اكتشفت أصلا HTS. 2 على الرغم من أن إنتاجية مجال الصناعات الدوائية قد عانت في الآونة الأخيرة من نقص في اكتشاف كيانات كيميائية جديدة، يمكن أن تحسن من احتمالات اكتشاف المخدرات ناجحة من خلال زيادة عدد المبيضات ما قبل السريريةقسم التدريب والامتحانات التي تظهر الخصائص البيولوجية / الكيمياء الحيوية تغييري. وفقا لذلك، يمكن وضع المقايسات HTS جديدة تكييفها لفحص المظهري توفر القدرة على توفير أدوات الدوائية هامة لاكتشاف يضرب دواء جديد. 3، 4، 5، 6 وعلاوة على ذلك، HTS يمكن الآن إجراء بوتيرة أسرع بسبب التحولات التكنولوجية الكبيرة في السنوات الأخيرة بما في ذلك منشآت مصممة خصيصا مرنة الروبوتية، تقنيات قرأ الرواية والتصغير واسعة النطاق. 2، 7 من بين العوامل التي تسهم في الاهتمام المتزايد في استخدام الفحص المظهري (ويعرف أيضا باسم الأمام الصيدلة) هو الاعتقاد بأن تركز على الآثار الوظيفية بدلا من الافتراضات الاختزالية التبسيط بشأن أهداف جزيئية (فحص / التفاعلات الكيميائية الحيوية القائمة على الهدف) هو الأرجح إلى sho الفعالية السريرية ث. وهكذا، وفحص المظهري يبشر لكشف المركبات يحتمل أن تكون علاجية جديدة والمسارات الجزيئية للأمراض غير قابلة للعلاج حاليا. 2
لتحديد مثبطات أو تفعيل لهدف الجزيئية معين أو وظيفة الخلوية بشكل صحيح، لا بد من فحص حساسة للغاية ويمكن الاعتماد عليها من أجل التفريق بين يضرب النية الحسنة وايجابيات كاذبة. لذلك، ما يجعل فحص جيد؟ نوعية فحص معين يجب أن يكون الحكم لأول مرة من قبل نسبة الإشارة إلى الضوضاء (يتجلى من خلال عامل Z). 8 ثانيا، ينبغي أن توضع بوضوح التأثير المستهدف أو الهدف من الشاشة. على سبيل المثال، يمكن للنهج القائم على خلية وظيفية توفر مزايا هامة لفحص مستقبلات بدلا من مقايسة مصممة خصيصا لتقييم يجند مستقبلات ملزمة. والسبب في ذلك هو أن النهج الأخير لا يمكن التفريق بين ناهض وخصم بروابط.SS = "XREF"> 9 في المقابل، هو النهج القائم على خلية من المرجح أن تكون أكثر فعالية وظيفة مستقبلات يمكن تقييم مباشرة في النمط الظاهري البيولوجي (انتشار واعتقال دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، و / أو التمايز). ومع ذلك، لا بد من الإشارة إلى أن فحوصات الكيمياء الحيوية يمكن أن توفر مزايا هامة على فحوصات المظهري لأنها تتعدى على هدف داخل الخلايا المحددة. وهناك فحص كيميائي حيوي جيدا الأمثل عموما أقل مبعثر البيانات من الفحص المظهري في الوقت الذي تبسط بعد ذلك التحقيقات المتعلقة بالآلية الجزيئية المخدرات من العمل. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي لفحوصات القائم على الهدف أو البيوكيميائية هو فرصة لتضخيم معدل ضربات إيجابية كاذبة التي قد تؤثر على أهداف غير محددة عند اختباره في نظام بيولوجي (فقدان خصوصية درس في الأصل في مقايسة البيوكيميائية). 10 على الرغم من أن النقطة الفاصلة الراسخة بين يضرب السلبية والإيجابية يمكن أن تقلل من عدد من ايجابيات كاذبة طن غربلة أولية، واستخدام نظام ذي الصلة من الناحية الفسيولوجية محاكاة البيئة الخلوية المحلية مثل خلايا سليمة، النسيج كله أو الحيوان كله يبقى جوهر البندول تصميم الفحص. لذلك، وفحص المظهري يمكن اكتشاف الرصاص مع آثار المظهري البيولوجية / مرغوب فيه للأمراض مع أي أهداف المخدرات التي تم تحديدها دون معرفة مسبقة من نشاط المجمع أو طريقة العمل. 11
وتتعلق دراسة هذا القانون وتطوير واختبار وفحص المظهري الأمثل وقابلة للتكرار على أساس عنصرين هامين: نموذج الفأر المتاحة تجاريا وتتجمع الفرعية عائلة من المركبات الكيميائية. وفيما يتعلق نموذج حيواني، ويعتمد الفحص على استخدام الخلايا الليمفاوية المستمدة من سلالة الماوس (Nur77 GFP) بايواء كروموسوم اصطناعي البكتيرية التي تحتوي على الكاسيت الذي هو الدافع وراء التعبير عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) من خلال الالبريد Nur77 المروج. 12 ويستند السمة المميزة لهذا التحفيز على حقيقة أن Nur77 هو جين الفورية المبكرة يصل ينظم التالية مستقبلات الخلايا التائية (TCR) أو تحفيز مستقبلات B-الخلية (BCR). 12 أما بالنسبة للطريقة الفرز نفسها، وكان يستخدم نهجا للمساعدة في تجنب فحص نظائرها تافهة مع التقليل من الوقت اللازم لتقييم مكتبة الكيميائية كبيرة (> 10 5 مركبات). للقيام بذلك، واستغلال قاعدة بيانات من المركبات الكيميائية التي اختارها الكيميائيين الطبية باستخدام أدوات الفحص الظاهري لتحديد مركبات مماثلة طبوغرافيا باستخدام هياكل البذور الفعالة المعروفة باسم المراجع. يسمح هذا النهج لنا لفحص المركبات 4398 وهو ما يمثل مكتبة شاملة لأكثر من 136،000 الكيانات الكيميائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم استغلال العديد من الطرق للقراءة من أجل تطوير فحوصات HTS حساسة وموثوق بها. وتشمل هذه اللونية، الانارة أو أساليب الفلورسنت. على الرغم من أن وسائل اللونية هي بسيطة لانشاء، فإنها تتطلب إضافات متعددة من المواد الكيميائية التي قد تتداخل أو تعطيل الخلايا التي يجري اخت…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل صناديق ميرك Frosst البدء المقدمة من جامعة مونتريال. ونود أن نشكر الدكاترة جان Duchaine ودومينيك Salois من منصة عالية الإنتاجية في معهد للبحوث في علم المناعة والسرطان لمن المناقشة والتعليقات والتغذية المرتدة. Moutih رافع يحمل للبحوث أون سانتيه كيبيك جائزة فون جديد 1.
Materials
| Nur77GFP mice | The Jackson Laboratory | Mouse strain No. 016617 | An in house colony was established at our animal facility |
| 96 wells-U culture plates, sterile | VWR International | 10062-902 | T-cell activation using the magnetic beads |
| 70µm cell strainer, sterile | Corning Inc. | 352350 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 5 ml polystyrene round bottom tubes, sterile | Corning Inc. | 352058 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes, sterile | VWR International | 89039-656 | Generation of splenocytes cell suspension |
| 10 ml syringe without needle, sterile | Becton, Dickinson and Company | 305482 | To mash the spleen |
| T-25 culture flask | Greiner Bio-One | 690 175 | To incudabte B cells during activation |
| 5 ml cell culture dish, sterile | Greiner Bio-One | 627 160 | To mash the spleen |
| Penicillin- Streptomycin (10,000 U/mL) | WISENT Inc. | 450-200-EL | Component of the splenocyte media |
| RPMI 1600 with sodium bicarbonate and L- glutamine | WISENT Inc. | 350-002-CL | Component of the splenocyte media |
| MEM non-essential amino acids | WISENT Inc. | 321-010-EL | Component of the splenocyte media |
| HEPES free acid 1 M | WISENT Inc. | 330-050-EL | Component of the splenocyte media |
| Sodium pyruvate solution (100mM) | WISENT Inc. | 600-110-EL | Component of the splenocyte media |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | WISENT Inc. | 080-910 | Component of the splenocyte media and flow-cytometry buffer |
| Phosphate buffered saline (PBS) | WISENT Inc. | 311-010-CL | Component of flow-cytometry buffer |
| 2-Mercaptoethanol (55mM) | Thermo Fisher Scientific | 21985-023 | Component of the splenocyte media |
| T- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19851 | To isolate T cells |
| B- Cells isolation kit | Stemcell Technologies | 19854 | To isolate B cells |
| Mouse T-Activator CD3/CD28 superparamagnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 11452D | To activate T cells |
| Cell isolation magnet | Stemcell Technologies | 18000 | To isolate T cells and remove the magnetic beads |
| AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG + IgM (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. | 115-006-068 | To stimulate B cells |
| Recombinant Murine IL-7 | Peprotech | 217-17 | To support T-cell survival during activation |
| Recombinant CD40L | R&D Systems | 8230-CL/CF | To stimulate B cells |
| Anti-mouse CD3 antibody | BD Pharmingen | 561799 | To stain T cells for flow-cytometry |
| Anti-mouse CD19 antibody | BD Pharmingen | 553786 | To stain B cells for flow-cytometry |
| Biomed FXp | PerkinElmer Inc. | A31842 | To re-suspend cells after 24 hours incubation |
| Opera Phenix High Content Screening System | PerkinElmer Inc. | HH14000000 | To analyze GFP/Hoechst signal |
References
- Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nat Rev Drug Discov. 10 (7), 507-519 (2011).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nat Rev Drug Discov. 10 (3), 188-195 (2011).
- Lokey, R. S. Forward chemical genetics: progress and obstacles on the path to a new pharmacopoeia. Curr Opin Chem Biol. 7 (1), 91-96 (2003).
- Hall, S. E. Chemoproteomics-driven drug discovery: addressing high attrition rates. Drug Discov Today. 11 (11-12), 495-502 (2006).
- Pruss, R. M. Phenotypic screening strategies for neurodegenerative diseases: a pathway to discover novel drug candidates and potential disease targets or mechanisms. CNS Neurol Disord Drug Targets. 9 (6), 693-700 (2010).
- St Onge, R., Schlecht, U., Scharfe, C., Evangelista, M. Forward chemical genetics in yeast for discovery of chemical probes targeting metabolism. Molecules. 17 (11), 13098-13115 (2012).
- Houston, J. G., Banks, M. N., Binnie, A., Brenner, S., O’Connell, J., Petrillo, E. W. Case study: impact of technology investment on lead discovery at Bristol-Myers Squibb. Drug Discov Today. 13 (1-2), 44-51 (2008).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4 (2), 67-73 (1999).
- Walters, W. P., Namchuk, M. Designing screens: how to make your hits a hit. Nat Rev Drug Discov. 2 (4), 259-266 (2003).
- Zheng, W., Thorne, N., McKew, J. C. Phenotypic screens as a renewed approach for drug discovery. Drug Discov Today. 18 (21-22), 1067-1073 (2013).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24 (2), 167-175 (2006).
- Moran, A. E., et al. T cell receptor signal strength in Treg and iNKT cell development demonstrated by a novel fluorescent reporter mouse. J Exp Med. 208 (6), 1279-1289 (2011).
- Kovacic, N., Müthing, J., Marusic, A. Immunohistological and Flow Cytometric Analysis of Glycosphingolipid Expression in Mouse Lymphoid Tissues. J Histochem Cytochem. 48, 1677-1689 (2000).
- Shapiro, H. M. Flow cytometric estimation of DNA and RNA content in intact cells stained with hoechst 33342 and pyronin Y. Cytometry. 2, 143-150 (1981).
- Zanella, F., Lorens, J. B., Link, W. High content screening: seeing is believing. Trends Biotechnol. 28 (5), 237-245 (2010).
- An, W. F. Fluorescence-based assays. Methods Mol Biol. 486, 97-107 (2009).
- Kishimoto, H., Sprent, J. Strong TCR ligation without costimulation causes rapid onset of Fas-dependent apoptosis of naive murine CD4+ T cells. J Immunol. 163 (4), 1817-1826 (1999).
- Schluns, K. S., Kieper, W. C., Jameson, S. C., Lefrancois, L. Interleukin-7 mediates the homeostasis of naive and memory CD8 T cells in vivo. Nat Immunol. 1 (5), 426-432 (2000).
- Jiang, Q., et al. Cell biology of IL-7, a key lymphotrophin. Cytokine Growth Factor Rev. 16 (4-5), 513-533 (2005).
- Koenen, P., et al. Mutually exclusive regulation of T cell survival by IL-7R and antigen receptor-induced signals. Nat Commun. 4, 1735 (2013).
- Vella, A., Teague, T. K., Ihle, J., Kappler, J., Marrack, P. Interleukin 4 (IL-4) or IL-7 prevents the death of resting T cells: stat6 is probably not required for the effect of IL-4. J Exp Med. 186 (2), 325-330 (1997).
- Hawkins, C. J., Vaux, D. L. The role of the Bcl-2 family of apoptosis regulatory proteins in the immune system. Semin Immunol. 9 (1), 25-33 (1997).
- Sumantran, V. N. Cellular chemosensitivity assays: an overview. Methods Mol Biol. 731, 219-236 (2011).
- Huh, S., et al. A cell-based system for screening hair growth-promoting agents. Arch Dermatol Res. 301 (5), 381-385 (2009).
- Weiss, A. TCR signal transduction: opening the black box. J Immunol. 183 (8), 4821-4827 (2009).
- Noel, P. J., Boise, L. H., Green, J. M., Thompson, C. B. CD28 costimulation prevents cell death during primary T cell activation. J Immunol. 157 (2), 636-642 (1996).
- Michels, A. W., et al. Structure-based selection of small molecules to alter allele-specific MHC class II antigen presentation. J Immunol. 187 (11), 5921-5930 (2011).
