Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu
Summary
Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.
Abstract
Büyük memeli pancreata gelen perfüzyon tabanlı adacık izolasyon protokolleri iyi bilinmektedir. Bu tür protokoller kolayca nedeniyle hazır kollajenaz enjeksiyonu ve sonraki doku perfüzyon için izin veren pankreas kanalının büyüklüğü birçok laboratuvarlarda yapılır. perfüzyon kolayca küçük pancreata başarılabilir değil çünkü aksine, küçük pancreata adacık izolasyonu, yenidoğan farelerin olduğu gibi, zordur. Burada görsel yardımı ile yeni doğan farelerin adacıklar önemli sayıda kurtarır ayrıntılı basit bir prosedür açıklanmaktadır. Taze parçalara Bütün pankreastan mikrosantrifüj tüpleri içinde, 37 ° C 'de Hanks Dengelenmiş Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde çözülmüş 0.5 mg / ml kollajenaz IV ile sindirildi. Tüpler doku dağılmasına yardımcı olması için düzenli olarak aday bulundu. doku en fazla 1 mm civarında küçük kümelere dağıtılmıştır zaman lizatları% 10 cenin sığır serumu (FBS) kültür ortamı ile dört kez yıkanmıştır. Adacık kümeler,tanınabilir asiner dokuların yoksun, daha sonra stereoskopla diseksiyon altında elde edilebilir. Yeni doğan fare pankreas başına büyük boyutlu adacıklar 80 küçük – Bu yöntem 20 kurtarır. Bu adacık insülin sekresyonu, gen ekspresyonu ve kültür dahil olmak üzere en akla alt deneyleri için uygundur. insülin salgılanması tahlilinin bir örneği, yalıtım işlemi doğrulamak için sunulmuştur. genetik altyapı ve sindirim derecesi verimi belirleyen en büyük faktörlerdir. Endokrin-ekzokrin izolasyon yardımcıları gibi yüksek aktiviteli taze hazırlanmış kolagenaz çözeltisi tercih edilir. Yıkama tüm çözümler ve fetal sığır serumu katyonların mevcudiyeti [Kalsiyum (Ca2 +) ve magnezyum (Mg + 2)] / çekme ortamı, uygun bir bütünlük adacık iyi bir verim için gerekli değildir. iyi kontrast ve büyütme ile bir diseksiyon kapsamı da yardımcı olacaktır.
Introduction
Isolating pure pancreatic islets is essential for assaying glucose stimulated insulin secretion (GSIS) of beta cells and for islet transplantation from cadaveric donors 1-3. It is also necessary to establish endocrine gene expression in islet cells 4, 5. For this purpose, detailed protocols have been established to allow for isolation of pancreatic islets from large pancreata (6 and references therein). These methods are based on enzymatic perfusion to dissociate acinar from islet tissues, coupled with gradient separation and hand picking. Thus, islet isolation from large pancreas can be performed readily in most laboratories. On the other hand, no detailed step-by-step protocol exists to allow for the isolation of islets from pancreata that are too small to perfuse.
Studying gene expression and function of neonatal islets is important. Neonate islets have different properties from adults in insulin secretion and proliferation capability 7, 8. However, isolating islets from newly born animals, especially mice is challenging due to the small size of the newly born pancreas. The size prevents the usual perfusion process when collagenase is injected though the pancreatic duct. Indeed, several papers have presented studies along these lines, with enzyme or non-enzyme aided isolation procedures 7, 9, 10. However, detailed description of the islet isolation process with visual aid is lacking 7, 9, making it a challenge for most researchers to perform similar studies.
We have explored several different conditions that yield high quality islets from neonatal mice. Here we present a protocol that is expected to help researchers learn the key details in the islet isolation process. This protocol is applicable to mouse pancreas up to two weeks of age, after which perfusion can be performed for routine islet isolation. Islets can be directly used for insulin secretion and gene expression assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, alışılmış perfüzyon için çok küçük pankreatasmdan adacığı izolasyonu adım adım protokolü sağlar. Vb beta hücresi saflaştırma, gen ekspresyon analizi, doku adacığı beta hücresi olgunlaşması, çoğalması, hücre stres yanıtları, hücrenin hayatta kalması, metabolizma ve fonksiyonel GSIS bakım, tüm doku adacığı temelli çalışmalar hazır adacıklar elde etmesi beklenmektedir. Bu bilgimiz, neonatal fareden adacık izolasyonunu gerçekleştirmek için yeni araştırmacı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant from NIDDK (DK065949 for GG). We thank Dr. Brenda M. Jarvis and Jeff Duryea Jr. for reading the manuscript.
Materials
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1X HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with seusequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrfuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. . Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
