Summary

Isolamento eficaz de ilhotas funcionais a partir de ratinho neonato Pâncreas

Published: January 06, 2017
doi:

Summary

Nós descrevemos um protocolo aqui para isolar ilhotas intactas de ratos recém-nascidos. Pâncreas foi parcialmente digerido com colagenase, seguido por lavagem e colheita manual. 20 – 80 agrupamentos de ilhéus podem ser obtidos por pâncreas de ratinhos recém-nascidos, que são adequados para vários estudos da ilhota.

Abstract

protocolos de isolamento de ilhotas-à base de perfusão de grande pâncreas de mamíferos estão bem estabelecidos. Tais protocolos estão prontamente realizado em muitos laboratórios, devido ao grande tamanho do ducto pancreático que permite a injecção pronto colagenase e subsequente perfusão tecidual. Em contraste, o isolamento de ilhotas do pâncreas pequena, como a de ratinhos neonatais, é um desafio porque perfusão não é facilmente realizável na pequena pâncreas. Aqui nós descrevemos um procedimento simples detalhado que recupera um número substancial de ilhotas de ratos recém-nascidos com assistência visual. pancreata inteiro recentemente dissecados foram digeridos com 0,5 mg / ml de colagenase IV dissolvido em Hanks 'Solução Salina Equilibrada (SSHE) a 37 ° C, em tubos de microcentrífuga. Os tubos foram aproveitado regularmente para ajudar a dispersão do tecido. Quando a maior parte do tecido foi disperso em pequenos aglomerados de cerca de 1 mM, lisados ​​foram lavados três a quatro vezes com meio de cultura com 10% de soro fetal de bovino (FBS). aglomerados de ilhotas,desprovidas de tecidos acinares reconhecíveis, pode então ser recuperado sob dissecando estereoscópio. Este método recupera 20 – 80 pequenas e ilhotas de grande porte por pâncreas de rato recém-nascido. Estas ilhotas são adequadas para ensaios a jusante mais possíveis, incluindo a secreção de insulina, a expressão do gene, e a cultura. Um exemplo do ensaio de secreção de insulina é apresentado para validar o processo de isolamento. O fundo genético e grau de digestão são os maiores fatores determinantes do rendimento. solução de colagenase recentemente feito com alta atividade é preferível, uma vez que auxilia no isolamento endócrino-exócrina. A presença de catiões [cálcio (Ca2 +) e magnésio (Mg2 +)] em todas as soluções e soro fetal de bovino na lavagem / meios de recolha são necessárias para um bom rendimento de ilhotas com integridade adequada. Um escopo de dissecação com bom contraste e ampliação também vai ajudar.

Introduction

Isolating pure pancreatic islets is essential for assaying glucose stimulated insulin secretion (GSIS) of beta cells and for islet transplantation from cadaveric donors 1-3. It is also necessary to establish endocrine gene expression in islet cells 4, 5. For this purpose, detailed protocols have been established to allow for isolation of pancreatic islets from large pancreata (6 and references therein). These methods are based on enzymatic perfusion to dissociate acinar from islet tissues, coupled with gradient separation and hand picking. Thus, islet isolation from large pancreas can be performed readily in most laboratories. On the other hand, no detailed step-by-step protocol exists to allow for the isolation of islets from pancreata that are too small to perfuse.

Studying gene expression and function of neonatal islets is important. Neonate islets have different properties from adults in insulin secretion and proliferation capability 7, 8. However, isolating islets from newly born animals, especially mice is challenging due to the small size of the newly born pancreas. The size prevents the usual perfusion process when collagenase is injected though the pancreatic duct. Indeed, several papers have presented studies along these lines, with enzyme or non-enzyme aided isolation procedures 7, 9, 10. However, detailed description of the islet isolation process with visual aid is lacking 7, 9, making it a challenge for most researchers to perform similar studies.

We have explored several different conditions that yield high quality islets from neonatal mice. Here we present a protocol that is expected to help researchers learn the key details in the islet isolation process. This protocol is applicable to mouse pancreas up to two weeks of age, after which perfusion can be performed for routine islet isolation. Islets can be directly used for insulin secretion and gene expression assays.

Protocol

utilização de animais segue os procedimentos especificados no protocolo M / 11/181 aprovado pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use Vanderbilt para Gu. ratinhos CD1 ou CBA / Bl6 foram adquiridos de fornecedores comerciais e cruzou no biotério Vanderbilt obter camundongos neonatais. 1. Preparação de Ratos, Soluções de Stock, and Equipment Para a cruz mouse: configurar uma cruz mouse e registrar as datas entupimento para auxiliar o planejamento experimental. ratinhos …

Representative Results

Em condições óptimas, o método apresentado pode rendimento de 20 – 80 de cada pequena ilhotas do pâncreas do rato. Este número depende do fundo genético, idade de ratinhos, e o tamanho das ilhotas para ser recuperado. Entre os comumente usados, CD1 fora de raça C57BL / 6J de raça pura produzem menos ilhotas com tamanho menor do que híbridos entre CD1 e C57BL / 6 ou B6CBAF1 comercial / mice J fazer. Mão directa colheita geralmente deu um menor número de ilhotas, provavelmente …

Discussion

Aqui, nós fornecemos um protocolo passo-a-passo de isolamento de ilhotas de pâncreas que são demasiado pequenos para perfusão convencional. Espera-se, para se obter ilhotas prontos para todos os estudos baseados em purificação de ilhotas, tais como beta-célula, a análise da expressão do gene, a maturação das células beta dos ilhéus pancreáticos, proliferação, as respostas de stress celular, sobrevivência celular, metabolismo, e manutenção GSIS funcional, etc. Este será, para o melhor do noss…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grant from NIDDK (DK065949 for GG). We thank Dr. Brenda M. Jarvis and Jeff Duryea Jr. for reading the manuscript.

Materials

Collagenase  Type IV Sigma Aldrich, St Louis, MO C5138
1X HBSS with Ca2+/Mg2+ Mediatech/Cellgro, Manassas, VA MT21020CV If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. 
RPMI 1640 w/o glucose Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA 11879-020 Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with seusequent islet usage. 
Glucose Sigma Aldrich, St Louis, MO G-7021 
polysucrose and sodium diatrizoate solution Sigma Aldrich, St Louis, MO Histopaque-10771
Stereoscope Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany Stemi2000
Stereoscope Leica, Wetzlar, Germany Leica M165
Microcentrifuge Eppendorf, Hauppauge, NY Centrifuge 5417C
Centrfuge Eppendorf, Hauppauge, NY Centrifuge 5810R
15-ml centrfuge tubes  VWR, Radnor, PA 89039-666
50-ml centrfuge tubes  VWR, Radnor, PA 89039-658
Precision balance VWR, Radnor, PA VWR-225AC
Microfuge tubes VWR, Radnor, PA 87003-294
Pipetman P1000 Fisher Scientific,  Waltham, MA F123602
Pipetman P20 Fisher Scientific,  Waltham, MA F123600
100X15 millimeter dish VWR, Radnor, PA 25384-088
60X15 millimeter dish VWR, Radnor, PA 25384-168
12-well plates VWR, Radnor, PA 665-180
Scissor Fine Scientific Tools, Foster City, CA 14080-11
Tweezers Fine Scientific Tools, Foster City, CA 5708-5
CD1 mice Charles River Laboratories, Wilminton, MA  CD-1
C57BL/6J The Jackson laboratory, Farmington, CT  C57BL/6J
B6CBAF1/J The Jackson laboratory, Farmington, CT  B6CBAF1/J

References

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Cite This Article
Huang, C., Gu, G. Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas. J. Vis. Exp. (119), e55160, doi:10.3791/55160 (2017).

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