בידוד יעיל של איי פונקציונלית מן היילודים עכבר לבלב
Summary
אנו מתארים פרוטוקול בזאת לבידוד איים שלמים מעכברים בילוד. Pancreata היו מעוכל חלקית עם collagenase, ואחריו כביסה בחירה ידנית. 20 – 80 אשכולות איון ניתן להשיג לכל לבלב מעכברים שזה עתה נולדו, אשר מתאימים מספר מחקרי איון.
Abstract
זלוף מבוסס פרוטוקולי איון-במנותק pancreata היונק הגדול מבוססים היטב. פרוטוקולים כאלה נערכים בקלות במעבדות רבות בשל גודלו של צינור הלבלב המאפשר להזרקת collagenase מוכנה זלוף רקמות שלאחר מכן. לעומת זאת, בידוד איון מ pancreata הקטן, כמו זה של עכברים בילוד, הוא מאתגר בגלל זלוף הוא לא בר השגה בקלות את pancreata הקטן. כאן אנו מתארים הליך פשוט מפורט משחזרים מספרים משמעותיים של איים מעכברים שזה עתה נולדו עם סיוע חזותי. pancreata כולו גזור טרי היו מתעכל עם 0.5 מ"ג / מ"ל collagenase IV מומס תמיסת מלח מאוזן "הנקס (HBSS) על 37 מעלות צלזיוס, צינורות microcentrifuge. צינורות היו טפח באופן קבוע כדי לסייע בפיזור רקמות. כאשר רוב הרקמה פוזרה לאשכולות קטנים סביב 1 מ"מ, lysates נשטף שלושה עד ארבעה פעמים עם תקשורת ותרבות עם 10% בסרום שור עוברי (FBS). אשכולות איילט,נטול רקמות acinar לזיהוי, ניתן לשחזר אז תחת לנתח סטריאוסקופ. שיטה זו משחזרת 20 – 80 קטנה עד איים גדולים בגודל לכל לבלב של עכבר שזה עתה נולד. איים אלה מתאימים מבחנים במורד זרם על הדעת ביותר, כולל הפרשת אינסולין, ביטוי גנים, ותרבות. דוגמא assay הפרשת אינסולין מוצגת כדי לאמת את תהליך הבידוד. הרקע הגנטי ומידת העיכול הם הגורמים הגדולים בקביעת התשואה. טרי פתרון collagenase עשה עם פעילות גבוהה הוא מועדף, כפי שהוא מסייע בבידוד אנדוקריני אקסוקרינית. הנוכחות של קטיונים [סידן (Ca 2 +) ומגנזיום (Mg 2+)] בכל פתרונות בסרום שור העובר בכביסה / מדיה לקטוף נחוצים תשואה טובה של איים ביושר ראוי. היקף ניתוחים עם ניגודיות והגדלה טובות יעזור גם.
Introduction
Isolating pure pancreatic islets is essential for assaying glucose stimulated insulin secretion (GSIS) of beta cells and for islet transplantation from cadaveric donors 1-3. It is also necessary to establish endocrine gene expression in islet cells 4, 5. For this purpose, detailed protocols have been established to allow for isolation of pancreatic islets from large pancreata (6 and references therein). These methods are based on enzymatic perfusion to dissociate acinar from islet tissues, coupled with gradient separation and hand picking. Thus, islet isolation from large pancreas can be performed readily in most laboratories. On the other hand, no detailed step-by-step protocol exists to allow for the isolation of islets from pancreata that are too small to perfuse.
Studying gene expression and function of neonatal islets is important. Neonate islets have different properties from adults in insulin secretion and proliferation capability 7, 8. However, isolating islets from newly born animals, especially mice is challenging due to the small size of the newly born pancreas. The size prevents the usual perfusion process when collagenase is injected though the pancreatic duct. Indeed, several papers have presented studies along these lines, with enzyme or non-enzyme aided isolation procedures 7, 9, 10. However, detailed description of the islet isolation process with visual aid is lacking 7, 9, making it a challenge for most researchers to perform similar studies.
We have explored several different conditions that yield high quality islets from neonatal mice. Here we present a protocol that is expected to help researchers learn the key details in the islet isolation process. This protocol is applicable to mouse pancreas up to two weeks of age, after which perfusion can be performed for routine islet isolation. Islets can be directly used for insulin secretion and gene expression assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
כאן, אנו מספקים צעד אחר צעד פרוטוקול על בידוד איון מ pancreata כי הם קטנים מדי עבור זלוף קונבנציונלי. זה צפוי להניב אי מוכן לכל מחקרים מבוססי האיון כגון טיהור בטא תאים, ניתוח ביטוי גנים, התבגרות בטא תאי איון, התפשטות, תגובות דחק תא, הישרדות תא, מטבוליזם, ותחזוקת GSIS פונקציונל?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grant from NIDDK (DK065949 for GG). We thank Dr. Brenda M. Jarvis and Jeff Duryea Jr. for reading the manuscript.
Materials
| Collagenase Type IV | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C5138 | |
| 1X HBSS with Ca2+/Mg2+ | Mediatech/Cellgro, Manassas, VA | MT21020CV | If HBSS wihout Ca2+/Mg2+ is obtained, CaCl2 and MgSO4 can be added to 1.26 and 0.5 mM, respectively. |
| RPMI 1640 w/o glucose | Thermo Fisher Scientific/Life Technologies, Waltham, MA | 11879-020 | Glucose needs to be added to specific levels to not interfere with seusequent islet usage. |
| Glucose | Sigma Aldrich, St Louis, MO | G-7021 | |
| polysucrose and sodium diatrizoate solution | Sigma Aldrich, St Louis, MO | Histopaque-10771 | |
| Stereoscope | Carl-Zeiss, Oberkochen, Germany | Stemi2000 | |
| Stereoscope | Leica, Wetzlar, Germany | Leica M165 | |
| Microcentrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5417C | |
| Centrfuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | Centrifuge 5810R | |
| 15-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-666 | |
| 50-ml centrfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 89039-658 | |
| Precision balance | VWR, Radnor, PA | VWR-225AC | |
| Microfuge tubes | VWR, Radnor, PA | 87003-294 | |
| Pipetman P1000 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123602 | |
| Pipetman P20 | Fisher Scientific, Waltham, MA | F123600 | |
| 100X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-088 | |
| 60X15 millimeter dish | VWR, Radnor, PA | 25384-168 | |
| 12-well plates | VWR, Radnor, PA | 665-180 | |
| Scissor | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 14080-11 | |
| Tweezers | Fine Scientific Tools, Foster City, CA | 5708-5 | |
| CD1 mice | Charles River Laboratories, Wilminton, MA | CD-1 | |
| C57BL/6J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | C57BL/6J | |
| B6CBAF1/J | The Jackson laboratory, Farmington, CT | B6CBAF1/J |
References
- Matsumoto, S., et al. Improvement of pancreatic islet cell isolation for transplantation. Proc (Bayl Univ Med Cent). 20 (4), 357-362 (2007).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Zhao, A., et al. Galphao represses insulin secretion by reducing vesicular docking in pancreatic beta-cells. Diabetes. 59 (10), 2522-2529 (2010).
- Planas, R., et al. Gene expression profiles for the human pancreas and purified islets in type 1 diabetes: new findings at clinical onset and in long-standing diabetes. Clin Exp Immunol. 159 (1), 23-44 (2010).
- Tonne, J. M., et al. Global gene expression profiling of pancreatic islets in mice during streptozotocin-induced beta-cell damage and pancreatic Glp-1 gene therapy. Dis Model Mech. 6 (5), 1236-1245 (2013).
- London, N. J., Swift, S. M., Clayton, H. A. Isolation, culture and functional evaluation of islets of Langerhans. Diabetes Metab. 24 (3), 200-207 (1998).
- Rorsman, P., et al. Failure of glucose to elicit a normal secretory response in fetal pancreatic beta cells results from glucose insensitivity of the ATP-regulated K+ channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (12), 4505-4509 (1989).
- Hellerstrom, C., Swenne, I. Functional maturation and proliferation of fetal pancreatic beta-cells. Diabetes. 40 (Suppl 2), 89-93 (1991).
- Blum, B., et al. Functional beta-cell maturation is marked by an increased glucose threshold and by expression of urocortin 3. Nat Biotechnol. 30 (3), 261-264 (2012).
- Hegre, O. D., et al. Nonenzymic in vitro isolation of perinatal islets of Langerhans. In Vitro. 19 (8), 611-620 (1983).
- Dolenšek, J., Rupnik, M. A., Stožer, A. Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas. Islets. 7 (1), e102445 (2015).
- White, J., White, D. C. . Source Book of Enzymes, Source Book of Enzymes. , (1997).
- Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas. Diabetes. 54 (1), 133-137 (2005).
- Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
