Summary

Xeno-ücretsiz Koşullarda 3-D Kültürler Üretim ve Tedavi Mezenkimal Kök Yönetim / Stromal Cell (MSC) küremsi Astarlı

Published: March 18, 2017
doi:

Summary

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Abstract

Mezenkimal kök / stromal hücreler (MKH) Biyomühendislik ve rejeneratif tıpta büyük umutlar tutun. MSC'ler doku kültür plastik güçlü yapışması ile birden fazla yetişkin dokulardan izole edildi ve daha sonra en sık fetal sığır serumu (FBS) ile, in vitro olarak genişletilebilir. FBS MKH'ler immünojenik hale gelmesine neden olabilir beri, MSC kültürlerde varlığını hücrelerin hem klinik hem de deneysel uygulamalar sınırlar. MSC kültürleri Bu nedenle, çalışmalar kimyasal olarak tanımlanmış istihdamı xeno-free (XF) medya son derece değerlidir. MSC yararlı etkilerinin büyük bir tümör nekroz faktörü ile uyarılan gen 6 (TSG6) ve prostaglandin E2 (PGE2) gibi başlıca bağışıklık faktörlerin salgılanması sayesinde, inflamasyon ve bağışıklık düzenleme kabiliyetleri bağlanmıştır. Ancak, MKH bu faktörlerin üretmek için aktivasyon gerektirir ve MKH etkisi genellikle geçicidir, çünkü büyük ilgi hücreleri Prio öncesi aktive yollarını keşfetmek için ortaya çıkmıştırkullanımlarına R, ve böylece in vivo olarak aktivasyon için gecikme süresini ortadan kaldırır. Burada üç boyutlu (3D) kültürlerde etkili bir şekilde harekete geçirmek için protokoller ya da asal MKH'lerin sunuyoruz kimyasal olarak tanımlanmış XF koşullar altında ve in vivo bu ön-aktifleştirilmiş MKH'lerin uygulanması. Özellikle, ilk XF orta kullanarak küresel MSC mikro dokuları veya asılı damla 'parçacıklarının' oluşturmak ve küreler ve klimalı ortam (CM) çeşitli uygulamalar için hasat edilebilir göstermek için yöntemler açıklanmaktadır. İkinci olarak, gen ekspresyon ekranlarını tarif ve in vitro fonksiyonel deneyleri, hızlı hücre anti-enflamatuar ve anti-kanser potansiyeli vurgulayan parçacıklarının MSC aktivasyon seviyesini değerlendirmek. Üçüncü olarak, in vivo etkinliği test etmek için, fare periton boşluğuna sağlam MSC sferoidler enjekte etmek için yeni bir yöntem açıklanmaktadır. Genel olarak, protokoller burada kimyasal olarak tanımlanmış XF con altında önceden etkinleştirilmiş MKH'lerin elde büyük zorlukların üstesindenkoşullarına ve tedaviler için MSC parçacıklarının yönetmek için esnek bir sistem sağlamak.

Introduction

Mezenkimal kök / stromal hücreler (MKH), çeşitli rejeneratif tıp yaklaşımları için büyük bir potansiyel göstermiştir. MSC'ler, başlangıçta, kemik iliği stromal bileşeni olarak izole edildi, ancak bu yana adipoz doku 1, 2, 3 dahil olmak üzere, pek çok diğer yetişkin dokulardan elde edilmiştir. İlginç bir şekilde, temel izolasyon yöntemi MSC gibi önemli bir özelliğe fetal sığır serumu (FBS) varlığında doku kültürü plastik üzerine sıkı bir şekilde yapışmasına içine alır. Bu geleneksel izolasyon tekniği iki boyutlu (2D) kültüründe MKH kolay ve hızlı genişlemesine izin veren iken, 5, aynı zamanda çok yapay ve önemli hücresel özellikleri 4 potansiyel kaybına yol açan doğal üç boyutlu (3D) çevrenin önemini göz ardı 6. Bu nedenle, 3D kültürlerde MSC çalışma, buradageleneksel 2B kültürlerin daha fizyolojik olan "kayıp / azalmış" MSC özellikleri arayışında ortaya çıkmıştır. Ayrıca, büyük ilgi klinik uygulamalar için hücreler daha müsait hale böylece MSC kültür ve aktivasyonu için xeno-free (XF) kimyasal olarak tanımlanmış koşulları tanımlamak ve yükseldi.

Birçok çalışma biyomalzeme ve küresel agrega ya da küresel cisimler hem MKH 3D kültürünü gösteren yayınlanmıştır. MKH sfero kültürleri klinik öncesi veya klinik çalışmalarda tedaviler için hücrelerin uygulanmasından sonra in vivo MSC davranışlarını anlamak için bir yol olarak görüldü oysa biyomalzeme MKH başlangıçta, hücre numaralı seribaşı iskeleleri ile hasarlı dokuların yerine doku mühendisliği yaklaşımları için tasarlanmış 4, 5, 7. İlginçtir, MKH formu sferoidler kendiliğinden doku kültürü plastik bağlılık izin verilmez zaman8, 9, 10. Geleneksel olarak, hücre birikme Spinner şişesi yöntemleri ya da sıvı kaplama teknikleri, tümör mikro taklit deneyin çabalarında Kanser biyolojisinde başlangıç ​​olarak kullanılan yöntemler ile kolaylaştırıldı. Daha yakın zamanda, ilave yöntemler kültür tabaklarına hücre toplanması hücre-plastik yapışma 4, 5, 6 önlemek için özel kimyasallar ile önceden kaplanmış göstermektedir ki ortaya çıktı. MSC sferoidler oluşturmak için en basit ve en ucuz yöntemlerden biri, genellikle, embriyonik kök hücreleri embriyoid organları üretmek için kullanılan bir teknik, asılı damla kültür bunların etmektir. damla kültürü tekniği asılı olan, doku kültürü plastik hücre yapışması, hücre aggreg kolaylaştırmak için yerçekimi, bir doku kültürü kabı kapağının altında ortamının bir drop içinde süspansiyona ettirilip engellenirdamla tepesinde yer tirme. sfero boyutu kolayca, hücre konsantrasyonunu veya açılan hacmini değiştirerek kontrol etmek son derece kolay asılı damla kültürleri yaparak manipüle edilebilir.

MKH 3D kültürü üzerindeki ilk çalışmalar onların 2B meslektaşları 6, 8, 9 ile karşılaştırıldığında 3D hücrelerin özelliklerinde radikal farklılıklar göstermiştir. Aynı zamanda, in vivo koşullarında raporlar MSC yararlı etkileri, yanıt olarak, mikro çevre hareketlerine göre aktive olma, anti-enflamatuar ve bağışıklık düzenleyici olarak 11 üretme yetenekleri dayanıyordu olduğunu göstermiştir. İlginç bir şekilde, prostaglandin E2 (PGE2), tümör nekroz faktörü ile uyarılan gen 6 (TSG6), hepatosit büyüme faktörü (HGF) ve bu faktörlerin bir çok yol açan geleneksel 2D MSC daha MSC sferoidler göre çok daha büyük miktarlarda üretilmiştir fikrihücreler 8, 12, 13 aktif hale getirmek için 3D kültürleri kullanılmıştır. Ayrıca, 3D kültürlerinde gen aktivasyon fareler 12 içine enjeksiyondan sonra hücre aktivasyonunun, en azından kısmen, mekanizmaları özetlemek ortaya çıktı. In vivo geleneksel MSC etkisi genellikle gecikmeli ve geçici ve "vurmak ve koşmak" olarak tarif edilebilir gibi deneylerde bunların kullanımdan önce MKH'lerin aktive ederek, hücrelerin etkileri uzun süreli ve daha belirgin olabilir. Geçtiğimiz birkaç yıl boyunca, MSC küremsilerin kullanılması önemli fonksiyonel çalışmalar, bunların enflamatuar cevapları bastırma ve sferoidler hazırlanmış MSC 2 çekici formu hale makrofajlar, dendritik hücreler, nötrofiller ve T hücreleri gibi efektör hücrelerin etkileyerek, in vivo olarak bağışıklık modüle olduğunu göstermiştir 3. Buna ek olarak, int anti-kanser moleküllerinin üretimierleukin-24 (IL-24) ve tümör nekroz faktörü ile ilgili apoptoz-indükleyici ligand (TRAIL), erişkin mono tabakasına MSC'ler nisbetle 3D kültürlerinde hedeflenen kanser tedavileri 8, 10, 14 için yararlanılabilir bir olgu artar.

Geleneksel MSC kültür doku kültürü plastik değil, aynı zamanda FBS kullanımı sadece gerektiği gibi klinik kullanımı aşılması gereken vardı, başka bir engel MSC sferoidler daha müsait hale getirmek için. Bu engel üstesinden gelmek için, son zamanlarda, belirli kimyasal olarak tanımlanmış XF koşulları altında MSC parçacıklarının oluşumunu göstermiştir ve elde edilen MSC sferoidler FBS 14 koşullarda üretilen parçacıklarının aynı anti-enflamatuar ve anti-kanser molekülleri üretmek üzere aktive edilmiştir saptamıştır. Burada, bu bulgular XF kullanarak 3D kültürlerde önceden aktive MKH nesil gösteren birçok ayrıntılı protokoller sunulmuşturOrtam. Buna ek olarak, protokoller birlikte farelere sağlam sferoidler sunmak için pratik bir yöntem ile, anti-enflamatuar, bağışıklık düzenleyici ve anti-kanser etkilerine açısından MSC aktivasyon seviyelerini değerlendirmek için etkili yollar tarif eden sunulmaktadır.

Protocol

1. MSC İzolasyon ve Genişleme Erken geçiş Hazırlama Merkezi'nden MKH'lerin ve Erişkin Kök Hücre (Dağılımı elde http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) 15 olarak dondurulmuş flakon. Alternatif olarak, rutin bir protokol 14 aşağıdaki kemik iliği gelen MKH'lerin izole ve dondurulmuş şişeleri saklamak. minimum temel ortam (αMEM…

Representative Results

Geçerli çalışmada, asılı damla kültürleri kompakt küresel mikro-doku veya XF koşullarında aktive MKH 'sferoidler' üretmek için kullanılmıştır. Şekil 1'de araştırma yol haritası MKH kendini monte etmek için teşvik edilir sferoidler veya CM küre kaynaklı tedavi edici faktörler ile yüklenen sonra 72 saat için damla asılı asılı zaman sferoidlerde içine alınabilir ve potansiyel hem de kullanılan bu tasvir araştırma ve klinik uy…

Discussion

Bazı araştırmalar ve klinik uygulamalarda kullanım için uygun MSC çok onların yarar en üst düzeye çıkarmak için aktif, ve tercihen FBS olarak ksenogeneik ortam bileşenlerinden potansiyel antigenlerin gönderimini en aza indirmek için, kimyasal olarak tanımlanmış XF koşullar altında hazırlanmalıdır. Burada anlatılan protokollerin olarak,: 1) için yöntemler göstermiştir parçacıklarının oluşumuyla 3D kültür MKH'lerin aktive 2) XF koşullar altında MSC 3D aktivasyonuna ulaşırlar, 3) …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.

Materials

MEM-α (minimal essential medium alpha) ThermoFisher/Gibco 12561049; 12561056; 12561072 minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select Atlanta Biologicals S11595; S11510; S11550; S11595-24 component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine ThermoFisher/Gibco 25030081; 25030149; 25030164 component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher/Gibco 15070063 component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane MilliporeSigma SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE media sterilization
150 mm cell culture dish Nunc D8554 SIGMA cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator Thermo Fisher Model 3110 incubation of cultured cells
Early passage MCSs Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White NA preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath VWR 89501-468 warming media to 37 °C
Pipettes Eppendorf 492000904 manual liquid handling
Pipete-Aid Drummond Scientific Company 4-000-300 handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) Corning 4487; 4101; 4251; 4490 liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 ThermoFisher/Gibco 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution ThermoFisher/Gibco 25200056; 25200072; 25200114 lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube Corning/BD Falcon 352097 cell centrifugation
50 ml conical tube Corning/BD Falcon 352098 cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge Eppendorf/Fisher Scientific Model 5810R cell centrifugation
hemocytometer Fisher Scientific 26716 cell counting
trypan blue Sigma-Aldrich T8154 SIGMA dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) ThermoFisher/Gibco A1067501 Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) Stem Cell Technologies 5420 Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin) Gemini 800-120 Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin) Sigma-Aldrich A9731 SIGMA Component of xeno-free MSC media
8-channel pipette, 10 – 100 µL Eppendorf 022453904 preparation of hanging drops
Total RNA isolation Mini Kit Qiagen 74104 Total RNA extraction
Qiashredder Qiagen 79654 Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set  Qiagen 79254 On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 ALDRICH inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex VWR 97043-562 mixing sample
Spectrophotometer Biorad NA RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher/Applied Biosystems 4368814 transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays ThermoFisher/Applied Biosystems varies primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix ThermoFisher/Applied Biosystems 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) ABI Prizm NA real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube Eppendorf 22364111 cell centrifugation, sample collection and storage
(-80°C) freezer Thermo Fisher Model Thermo Forma 8695 sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit R&D Systems KGE004B estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) ThermoFisher/Gibco 10566-016; 10566-024;10566-032 macrophage culture media
J774 mouse macrophages ATCC TIB-67 mouse macrophage cell line
12-well plate Corning 3513 in-vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide) Sigma-aldrich L4130 in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit R&D Systems MTA00B estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit R&D Systems M1000B estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium ThermoFisher/Gibco 11875-085 splenocyte culture media
BALB/c mice The Jackson Laboratory 651 in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified eBioscience 145-2C11 In vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer  Corning 352350 Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x) Affymetrix eBioscience 00-4333 removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit R&D Systems MIF 00 estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells  ATCC CRL-1740 study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit ThermoFisher C7026 cell number measurement based on DNA content
NaCl Sigma-Aldrich S5150 component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) ThermoFisher FERR1021 calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A Qiagen 19101 RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader BMG Technology NA Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher/Gibco 14175079 resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane MWI Vet Supply 502017 Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas Praxair NA For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet Thermo Fisher Model 1385 Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch Terumo SR*FNP2025 Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips Eppendorf varies liquid/cells handling

References

  1. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  2. English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560 (2013).
  3. Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
  4. Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
  5. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357 (2016).
  6. Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  7. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
  8. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  9. Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  10. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
  13. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
  14. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
  15. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  16. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells’ Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
  19. Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
  20. Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
  21. Krampera, M. Mesenchymal stromal cell ‘licensing’: a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
  22. Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?. Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
  23. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  24. Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  25. Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).

Play Video

Cite This Article
Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Mohammadipoor, A., Bartosh, T. J. Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (121), e55126, doi:10.3791/55126 (2017).

View Video