Summary

الإنتاج والإدارة العلاجية الجذعية الوسيطة / اللحمية الخليوي (MSC) الأجسام الشبه الكروية معبى في الثقافات 3-D تحت ظروف كره خالية

Published: March 18, 2017
doi:

Summary

The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.

Abstract

الجذعية الوسيطة / الخلايا اللحمية (اللجان الدائمة) على وعود كبيرة في الهندسة الحيوية والطب التجديدي. اللجان الدائمة يمكن عزلها عن أنسجة البالغين متعددة عبر الالتزام القوي للالبلاستيك زراعة الأنسجة ومن ثم مزيد من التوسع في المختبر، والأكثر شيوعا باستخدام مصل بقري جنيني (FBS). منذ FBS يمكن أن يسبب اللجان الدائمة لتصبح مناعة، وجودها في الثقافات MSC يحد كلا التطبيقات السريرية والتجريبية من الخلايا. لذلك، دراسات توظيف تعريف كيميائيا (XF) وسائل الاعلام خالية من XENO للثقافات MSC قيمة للغاية. وقد أرجع العديد من الآثار المفيدة للاللجان الدائمة لقدرتها على تنظيم الالتهاب والمناعة، وذلك أساسا من خلال إفراز العوامل المناعية مثل نخر الورم حفز عامل الجينات 6 (TSG6) والبروستاغلاندين E2 (PGE2). ومع ذلك، اللجان الدائمة تتطلب تفعيل لإنتاج هذه العوامل ومنذ أثر من اللجان الدائمة في كثير من الأحيان عابرة، برز اهتمام كبير لاكتشاف طرق من قبل تنشيط خلايا PRIOr لاستخدامها، وبالتالي القضاء على الوقت الضائع لالتنشيط في الجسم الحي. هنا نقدم بروتوكولات لتفعيل كفاءة أو اللجان الدائمة الرئيسية في ثلاثي الأبعاد (3D) الثقافات في ظل ظروف XF محددة كيميائيا وإدارة هذه اللجان الدائمة تفعيلها مسبقا في الجسم الحي. على وجه التحديد، وصفنا أولا طرق لتوليد MSC كروية الأنسجة الصغيرة أو "الكروية" في شنقا قطرات باستخدام XF المتوسطة وشرح كيفية المجالات والمتوسطة مكيفة (CM) يمكن حصاده لمختلف التطبيقات. ثانيا، نحن تصف شاشات التعبير الجيني في المختبر المقايسات الفنية لتقييم بسرعة على مستوى تفعيل لجنة السلامة البحرية في الكروية، مع التركيز على إمكانات المضادة للالتهابات ومضاد للسرطان من خلايا. ثالثا، نحن تصف طريقة رواية لحقن الكروية MSC سليمة في التجويف البريتوني الماوس في الجسم الحي اختبار فعالية. وعموما، فإن البروتوكولات التغلب على هذه الوثيقة التحديات الكبرى للحصول على اللجان الدائمة تفعيلها مسبقا تحت تعريف كيميائيا يخدع XFditions وتوفر نظاما مرنا لإدارة الكروية MSC للعلاج.

Introduction

وقد أظهرت الجذعية الوسيطة / خلايا انسجة (اللجان الدائمة) إمكانات كبيرة لمختلف النهج الطب التجديدي. تم عزل اللجان الدائمة في البداية باعتبارها عنصرا انسجة نخاع العظام ولكن تم الحصول عليها منذ من العديد من أنسجة البالغين الأخرى، بما في ذلك الأنسجة الدهنية 3. ومن المثير للاهتمام، تحتضن طريقة العزلة الرئيسي خاصية رائعة من اللجان الدائمة التمسك بإحكام على البلاستيك زراعة الأنسجة في وجود مصل بقري جنيني (FBS). بينما تسمح هذه التقنية العزلة التقليدية التوسع السهل والسريع من اللجان الدائمة في ثنائية الأبعاد (2D) ثقافة، بل هو أيضا الاصطناعي للغاية ويتجاهل أهمية البيئة المحلية ثلاثي الأبعاد (3D) مما أدى إلى خسارة محتملة من الخصائص الخلوية مهمة 5 (6). ولذلك، فإن دراسة اللجان الدائمة في الثقافات 3D، التيأكثر الفسيولوجية من الثقافات 2D التقليدية، ظهرت في البحث عن خصائص MSC "فقدت / تقلص". وعلاوة على ذلك، ارتفع اهتماما كبيرا لتحديد الشروط (XF) خالية من XENO محددة كيميائيا للثقافة MSC والتنشيط، وبالتالي تجعل الخلايا أكثر تقبلا للتطبيقات السريرية.

وقد نشرت العديد من الدراسات يدل على ثقافة 3D من اللجان الدائمة في كل من المواد الحيوية وكما الركام كروية أو الكروية. وقد صممت اللجان الدائمة في المواد الحيوية في البداية لنهج هندسة الأنسجة لاستبدال الأنسجة التالفة مع السقالات خلية المصنفة، في حين شوهدت الثقافات كروي من اللجان الدائمة وسيلة لفهم السلوك MSC في الجسم الحي بعد تناوله من الخلايا للعلاج في التجارب ما قبل السريرية أو الإكلينيكية 4 و 5 و 7. ومن المثير للاهتمام، اللجان الدائمة شكل الكروية بشكل عفوي عندما التمسك البلاستيك زراعة الأنسجة غير مسموح 10. تقليديا، تم تسهيل تجميع الخلية عن طريق أساليب قارورة الدوار أو تقنيات تراكب السائلة وطرق استخدامها في البداية في بيولوجيا السرطان في جهود محاولة لتقليد المكروية الورم. وفي الآونة الأخيرة، ظهرت طرق إضافية التي تثبت تجميع الخلايا في أطباق ثقافة ما قبل المغلفة بمواد كيميائية محددة لمنع الخلية الى البلاستيك التصاق 6. واحد من أبسط وأكثر اقتصادا وسائل لتوليد الأجسام الشبه الكروية MSC هو ثقافة لهم في شنقا قطرات، وهي تقنية تستخدم غالبا للإنتاج الهيئات مضغي من الخلايا الجذعية الجنينية. مع شنقا تقنية ثقافة الإفلات، يتم منع التقيد الخلية إلى البلاستيك زراعة الأنسجة من خلال تعليق الخلايا في قطرة من المتوسط ​​على الجانب السفلي من غطاء الأنسجة صحن الثقافة والسماح خطورة لتسهيل aggreg خليةأوجه في قمة الهبوط. حجم كروي يمكن التلاعب بها بسهولة عن طريق تغيير تركيز الخلية أو حجم الانخفاض، مما يجعل انخفاض الثقافات شنقا سهلة جدا السيطرة.

أظهرت الدراسات المبكرة على الثقافة 3D من اللجان الدائمة اختلافات جذرية في خصائص الخلايا في 3D مقارنة مع نظرائهم 2D 9. وفي الوقت نفسه، أظهرت التقارير أن التأثيرات المفيدة للاللجان الدائمة في الجسم الحي تعتمد على قدرتها على أن تصبح تفعيلها من خلال الاشارات الصغيرة البيئية، وردا على ذلك، لإنتاج المضادة للالتهابات والمناعية عوامل 11. ومن المثير للاهتمام، تم إنتاج العديد من هذه العوامل مثل البروستاغلاندين E2 (PGE2)، نخر الورم حفز عامل الجينات 6 (TSG6)، وعامل النمو الكبدية (HGF) بكميات أكبر بكثير من الكروية MSC من اللجان الدائمة 2D التقليدية مما يمهد الطريق ل فكرة عناستخدام الثقافات 3D لتنشيط الخلايا 8 و 12 و 13. وعلاوة على ذلك، يبدو تفعيل الجين في الثقافات 3D لألخص الآليات، على الأقل جزئيا، من تنشيط الخلايا بعد حقن الفئران إلى 12. من خلال تفعيل اللجان الدائمة السابقة لاستخدامها في التجارب، والآثار المترتبة على خلايا يمكن أن تكون طويلة وأكثر بروزا في كثير من الأحيان يتم تأخير تأثير MSC التقليدي في الجسم الحي وعابرة، ويمكن وصفها بأنها "الكر والفر". خلال السنوات العديدة الماضية، وقد أثبتت الدراسات وظيفية هامة باستخدام الكروية MSC يتمكنوا من قمع الاستجابات الالتهابية وتعدل مناعة في الجسم الحي من خلال التأثير على الخلايا المستجيب مثل الضامة، والخلايا الجذعية، العدلات، والخلايا T جعل الكروية وشكل جذاب من اللجان الدائمة تستعد 2 3. وبالإضافة إلى ذلك، إنتاج جزيئات مضادة للسرطان، مثل كثافة العملياتerleukin 24 (IL-24)، ونخر الورم المتعلقة عامل يحفز الخلايا يجند (تريل)، وزاد في الثقافات 3D من اللجان الدائمة بالنسبة للأحادي الطبقة اللجان الدائمة، وهي الظاهرة التي يمكن استغلالها لعلاجات السرطان تستهدف 8 و 10 و 14.

وبما أن الثقافة لجنة السلامة البحرية التقليدية تتطلب ليس فقط استخدام البلاستيك زراعة الأنسجة ولكن أيضا FBS، عقبة أخرى لجعل الكروية MSC أكثر قابلية للاستخدام السريري كان لا بد من التغلب عليها. لمعالجة هذه العقبة، وأظهرت مؤخرا تشكيل الكروية MSC في ظل ظروف محددة XF محددة كيميائيا وأثبت أن الكروية MSC مما أدى تم تفعيلها لإنتاج نفس الجزيئات المضادة للالتهابات ومضادة للسرطان حيث الكروية ولدت في ظروف مع FBS 14. هنا، يتم عرض هذه النتائج في عدة بروتوكولات وإجراءات تفصيلية التي تبرهن على جيل من اللجان الدائمة تفعيلها مسبقا في الثقافات 3D باستخدام XFوسائل الإعلام. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عرض البروتوكولات التي تصف طرق فعالة لتقييم مستويات تفعيل اللجان الدائمة في ما يخص المضادة للالتهابات، المناعية والمضادة للسرطان آثارها، جنبا إلى جنب مع وسيلة عملية لتقديم الكروية سليمة في الفئران.

Protocol

1. عزل MSC والتوسع الحصول على اللجان الدائمة مرور وقت مبكر من مركز إعداد وتوزيع الخلايا الجذعية البالغة ( http://medicine.tamhsc.edu/irm/msc-distribution.html ) 15 قارورة كما المجمدة. بدل…

Representative Results

في العمل الحالي، كانوا يعملون شنقا الثقافات قطرة لتوليد المدمجة كروية الأنسجة الصغيرة أو "الكروية" من اللجان الدائمة تفعيلها في ظل ظروف XF. خارطة الطريق الفحص في الشكل 1 يصور أن يتم تشجيع اللجان الدائمة في تقرير المصير، تجميع في الكروي?…

Discussion

لجنة السلامة البحرية المثلى لاستخدامها في بعض التطبيقات البحثية والسريرية يجب تفعيلها للغاية لتحقيق أقصى قدر من مصلحتهم، وعلى استعداد تفضيلي في ظل ظروف XF محددة كيميائيا للحد من وصول المستضدات المحتملة من مكونات المتوسطة xenogeneic مثل FBS. في البروتوكولات المذكورة هنا، ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.

Materials

MEM-α (minimal essential medium alpha) ThermoFisher/Gibco 12561049; 12561056; 12561072 minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM)
FBS (fetal bovine serum), premium select Atlanta Biologicals S11595; S11510; S11550; S11595-24 component of complete culture media for all types of cells
L-glutamine ThermoFisher/Gibco 25030081; 25030149; 25030164 component of complete culture media for all types of cells
Penicillin/Streptomycin ThermoFisher/Gibco 15070063 component of complete culture media for all types of cells
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane MilliporeSigma SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE media sterilization
150 mm cell culture dish Nunc D8554 SIGMA cell culture
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator Thermo Fisher Model 3110 incubation of cultured cells
Early passage MCSs Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White NA preparation of 2D and 3D cultures of MSCs
water bath VWR 89501-468 warming media to 37 °C
Pipettes Eppendorf 492000904 manual liquid handling
Pipete-Aid Drummond Scientific Company 4-000-300 handling sereological pipetes
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) Corning 4487; 4101; 4251; 4490 liquid handling
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 ThermoFisher/Gibco 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 cell culture processing
0.25% trypsin/EDTA solution ThermoFisher/Gibco 25200056; 25200072; 25200114 lifting adherent cells and dispersing cell aggregates
15 ml conical tube Corning/BD Falcon 352097 cell centrifugation
50 ml conical tube Corning/BD Falcon 352098 cell centrifugation
Eppendor refrigerated centrifuge Eppendorf/Fisher Scientific Model 5810R cell centrifugation
hemocytometer Fisher Scientific 26716 cell counting
trypan blue Sigma-Aldrich T8154 SIGMA dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) ThermoFisher/Gibco A1067501 Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) Stem Cell Technologies 5420 Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells
HSA (Human serum albumin) Gemini 800-120 Component of xeno-free MSC media
rHSA (recombinant Human serum albumin) Sigma-Aldrich A9731 SIGMA Component of xeno-free MSC media
8-channel pipette, 10 – 100 µL Eppendorf 022453904 preparation of hanging drops
Total RNA isolation Mini Kit Qiagen 74104 Total RNA extraction
Qiashredder Qiagen 79654 Sample homogenization prior to total RNA extraction
RNAse-free DNase Set  Qiagen 79254 On-column DNA elimination during total RNA extraction
β-mercaptoethanol  Sigma-Aldrich M6250 ALDRICH inhibition of RNAses in RLT buffer
Vortex VWR 97043-562 mixing sample
Spectrophotometer Biorad NA RNA concentration and quality
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit ThermoFisher/Applied Biosystems 4368814 transcription of total RNA into cDNA
Gene Expression Assays ThermoFisher/Applied Biosystems varies primer/probe combination for real-time PCR
Fast Universal PCR Master Mix ThermoFisher/Applied Biosystems 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 master mix for real-time PCR reaction
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) ABI Prizm NA real-time PCR
1.5 ml centrifuge tube Eppendorf 22364111 cell centrifugation, sample collection and storage
(-80°C) freezer Thermo Fisher Model Thermo Forma 8695 sample storage
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit R&D Systems KGE004B estimation of cytokine concentration in the sample
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) ThermoFisher/Gibco 10566-016; 10566-024;10566-032 macrophage culture media
J774 mouse macrophages ATCC TIB-67 mouse macrophage cell line
12-well plate Corning 3513 in-vitro macrophage stimulation
LPS (lipopolysaccharide) Sigma-aldrich L4130 in vitro macrophage stimulation
Mouse TNF-a ELISA kit R&D Systems MTA00B estimation of cytokine concentration in the sample
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit R&D Systems M1000B estimation of cytokine concentration in the sample
RPMI-1640 medium ThermoFisher/Gibco 11875-085 splenocyte culture media
BALB/c mice The Jackson Laboratory 651 in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified eBioscience 145-2C11 In vitro splenocyte stimulation
70 μm strainer  Corning 352350 Splenocyte preparation
Red blood cell lysis solution (1x) Affymetrix eBioscience 00-4333 removal of red blood cells during splenocyte isolation
Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit R&D Systems MIF 00 estimation of cytokine concentration in the sample
LNCaP prostate cancer cells  ATCC CRL-1740 study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro
DNA-based cell proliferation assay kit ThermoFisher C7026 cell number measurement based on DNA content
NaCl Sigma-Aldrich S5150 component of lysis reagent
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) ThermoFisher FERR1021 calcium chelator, component of lysis reagent
Rnase A Qiagen 19101 RNA degradation for measurement of DNA
Filter-based multi-mode microplate reader BMG Technology NA Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.)
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red ThermoFisher/Gibco 14175079 resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections
Isoflurane MWI Vet Supply 502017 Anesthesia for in vivo injections
Oxygen, compressed gas Praxair NA For use with isoflurane
Thermo Forma BSL-2 cabinet Thermo Fisher Model 1385 Sterile cell culture
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch Terumo SR*FNP2025 Delivery of shperoids into peritoneal cavity
Sterile micropipette tips Eppendorf varies liquid/cells handling

References

  1. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: New directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
  2. English, K., Wood, K. J. Mesenchymal stromal cells in transplantation rejection and tolerance. Cold Spring Harb Perspect.Med. 3 (5), a015560 (2013).
  3. Le Blanc, K., Mougiakakos, D. Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system. Nat.Rev.Immunol. 12 (5), 383-396 (2012).
  4. Follin, B., Juhl, M., Cohen, S., Perdersen, A. E., Kastrup, J., Ekblond, A. Increased Paracrine Immunomodulatory Potential of Mesenchymal Stromal Cells in Three-Dimensional Culture. Tissue Eng.Part B.Rev. , (2016).
  5. Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells Int. , 9176357 (2016).
  6. Achilli, T. M., Meyer, J., Morgan, J. R. Advances in the formation, use and understanding of multi-cellular spheroids. Expert Opin.Biol. Ther. 12 (10), 1347-1360 (2012).
  7. Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng.Part B.Rev. 20 (5), 365-380 (2014).
  8. Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 107 (31), 13724-13729 (2010).
  9. Potapova, I. A., et al. Mesenchymal stem cells support migration, extracellular matrix invasion, proliferation, and survival of endothelial cells in vitro. Stem Cells. 25 (7), 1761-1768 (2007).
  10. Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Eng.Part C.Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
  11. Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs Improve Myocardial Infarction in Mice because Cells Embolized in Lung Are Activated to Secrete the Anti-inflammatory Protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
  12. Bartosh, T. J., Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Kuhlman, J., Prockop, D. J. Dynamic compaction of human mesenchymal stem/precursor cells into spheres self-activates caspase-dependent il1 signaling to enhance secretion of modulators of inflammation and immunity (PGE2, TSG6, and STC1). Stem Cells. 31 (11), 2443-2456 (2013).
  13. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Coble, K., Prockop, D. J. Human mesenchymal stem/stromal cells cultured as spheroids are self-activated to produce prostaglandin E2 that directs stimulated macrophages into an anti-inflammatory phenotype. Stem Cells. 30 (10), 2283-2296 (2012).
  14. Ylostalo, J. H., Bartosh, T. J., Tiblow, A., Prockop, D. J. Unique characteristics of human mesenchymal stromal/progenitor cells pre-activated in 3-dimensional cultures under different conditions. Cytotherapy. 16 (11), 1486-1500 (2014).
  15. Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
  16. Uccelli, A., Moretta, L., Pistoia, V. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat.Rev.Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  17. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  18. Fontaine, M. J., Shih, H., Schafer, R., Pittenger, M. F. Unraveling the Mesenchymal Stromal Cells’ Paracrine Immunomodulatory Effects. Transfus.Med.Rev. 30 (1), 37-43 (2016).
  19. Nemeth, K., et al. Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production. Nat.Med. 15 (1), 42-49 (2009).
  20. Prockop, D. J. Concise review: two negative feedback loops place mesenchymal stem/stromal cells at the center of early regulators of inflammation. Stem Cells. 31 (10), 2042-2046 (2013).
  21. Krampera, M. Mesenchymal stromal cell ‘licensing’: a multistep process. Leukemia. 25 (9), 1408-1414 (2011).
  22. Saleh, F. A., Genever, P. G. Turning round: multipotent stromal cells, a three-dimensional revolution?. Cytotherapy. 13 (8), 903-912 (2011).
  23. Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Eng.Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
  24. Yeh, H. Y., Liu, B. H., Hsu, S. H. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  25. Lee, E. J., et al. Spherical bullet formation via E-cadherin promotes therapeutic potency of mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord blood for myocardial infarction. Mol.Ther. 20 (7), 1424-1433 (2012).

Play Video

Cite This Article
Ylostalo, J. H., Bazhanov, N., Mohammadipoor, A., Bartosh, T. J. Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions. J. Vis. Exp. (121), e55126, doi:10.3791/55126 (2017).

View Video