The therapeutic potential of mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) is well-documented, however the best method of preparing the cells for patients remains controversial. Herein, we communicate protocols to efficiently generate and administer therapeutic spherical aggregates or ‘spheroids’ of MSCs primed under xeno-free conditions for experimental and clinical applications.
גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSCs) מחזיקים הבטחה גדולה Bioengineering ורפואה רגנרטיבית. MSCs יכול להיות מבודד רקמות בוגרות מרובות באמצעות הדבקות החזקה שלהם פלסטיק בתרבית רקמה ולאחר מכן להרחיב עוד יותר במבחנה, לרוב תוך שימוש בסרום שור עובר (FBS). מאז FBS יכול לגרום MSCs להפוך immunogenic, נוכחותה תרבויות MSC המגבילה הוא יישומים קליניים וניסויים של התאים. לכן, מחקרים והעסיקו עובדים ללא קסנו הגדרה כימית (XF) מדיה עבור תרבויות MSC היא יקרה ערך. השפעות מועילות רבות של MSCs יוחסו יכולתי לווסת דלקת חסינות, בעיקר באמצעות הפרשת גורמי מערכת חיסוניים כגון גן גורם מגורה נימק גידול 6 (TSG6) ו פרוסטגלנדין E2 (PGE2). עם זאת, MSCs מחייב הפעלה לייצר גורמים אלה שכן ההשפעה של MSCs היא לעתים קרובות חלף, עניין רב התפתח לגלות דרכים של טרום הפעלת PRIO התאיםr כדי השימוש בהם, ובכך לחסל את זמן השהיה עבור ההפעלה in vivo. כאן אנו מציגים פרוטוקולים כדי להפעיל ביעילות או MSCs הממשלה תלת ממדי (3D) תרבויות בתנאי XF הגדרה כימית ולנהל MSCs מראש מופעל אלה in vivo. באופן ספציפי, אנו מתארים שיטות ראשונות שיצרו MSC הכדורי-רקמות מייקרו או 'spheroids' בטיפות תלויות באמצעות מדיום XF ולהדגים כיצד הספירות והתנו הבינוני (CM) ניתן לקצור עבור יישומים שונים. שנית, אנו מתארים מסכי ביטוי גנים במבחנת מבחנים תפקודיים כדי להעריך את הרמה במהירות של הפעלת MSC ב spheroids, תוך שימת דגש על הפוטנציאל אנטי-דלקתי ואנטי-סרטני של התאים. שלישית, אנו מתארים שיטה חדשה להזריק spheroids MSC השלם לתוך חלל הצפק העכבר לבדיקות יעילות vivo. בסך הכל, את הפרוטוקולים בזאת להתגבר על האתגרים העיקריים של קבלת MSCs מראש מופעל תחת con XF הגדרה כימיתditions ולספק מערכת גמישה לניהול spheroids MSC עבור טיפולים.
גזע mesenchymal / בתאי סטרומה (MSCs) הראה פוטנציאל גדול עבור גישות רפואת רגנרטיבית שונות. MSCs בתחילה בודדו כמרכיב סטרומה של מח העצם אבל מאז התקבלו מחברת רקמות בוגרות רבות אחרות, כולל רקמת שומן 1, 2, 3. מעניין לציין, כי שיטת הבידוד העיקרית מחבק תכונה יוצאת דופן של MSCs להיצמד בחוזקה על פלסטיק בתרבית רקמה בנוכחות בסרום שור העובר (FBS). בעוד טכניקת בידוד המסורתית הזה מאפשרת רחבה קלה ומהירה של MSCs ב דו ממדים (2D) תרבות, זה גם מאוד מלאכותי ומתעלם משמעות של תלת ממדי (3D) בסביבה המקורית שמובילה לאובדן פוטנציאל של מאפיינים תאיים חשובים 4, 5 , 6. לכן, המחקר של MSCs בתרבויות 3D, אשרהם יותר פיסיולוגיים מאשר תרבויות 2D מסורתיות, התפתח בחיפוש עבור "אבדו / פחתה" מאפייני MSC. יתר על כן, עניין רב עלה לזהות תנאים מוגדרים קסנו-חינם (XF) כימי לתרבות הפעלת MSC, ובכך להפוך את התאים יותר נוחים עבור יישומים קליניים.
מחקרים רבים פורסמו הוכחת תרבות 3D של MSCs היא biomaterials וכפי אגרגטים או spheroids כדוריים. MSCs ב biomaterials בתחילה תוכנן עבור גישות הנדסת רקמות להחליף רקמות פגועות עם פיגומי תא זרע, ואילו תרבויות אליפטית של MSCs נראו כדרך להבין את התנהגות MSC in vivo לאחר מתן של התאים עבור טיפולים בניסויים פרה-קליניים או קליניים 4, 5, 7. מעניין, spheroids טופס MSCs ספונטני כאשר דבקות פלסטיק בתרבית רקמה אינה מותרת8, 9, 10. באופן מסורתי, צבירה התא התאפשרה על ידי שיטות בקבוק טווה או טכניקות כיסוי נוזלי, שיטות השתמשו בתחילה בביולוגיה סרטן במאמצים לנסות לחקות את המיקרו-סביבה של הגידול. לאחרונה, שיטות נוספות צצו ממחישי צבירת תא כלי תרבות מראש מצופית עם כימיקלים מסוימים כדי למנוע תא אל הפלסטיק דבק 4, 5, 6. אחת השיטות הפשוטות ביותר וחסכוני ליצור spheroids MSC היא תרבות אותם בטיפות תלויים, טכניקה ששימשה לעתים קרובות לייצר גופים embryoid מתאי גזע עובריים. עם תלוי טכניקת תרבות ירידה, דבקות תא הפלסטיק בתרבית רקמת נמנע בשל השעיית תאי ירידה של מדיום על החלק התחתון של מכסת צלחת בתרבית רקמה ומאפשר הכביד כדי להקל תא aggregation ב הקודקוד של ירידה. גודל אליפטית ניתן להשפיע בקלות על ידי שינוי ריכוז התא או נפח ירידה, מה שהופך תרבויות Drop Hanging במיוחד קל לשלוט.
מחקרים מוקדמים על תרבות 3D של MSCs הפגינו שוני קיצוני קיים בין המאפיינים של תאי 3D לעומת עמיתיהם 2D שלהם 6, 8, 9. במקביל, דיווחים הראו כי ההשפעות המיטיבות של MSCs in vivo הסתמכה על יכולתם להיות מופעל על ידי רמזים מיקרו-סביבתיים, בתגובה, כדי לייצר אנטי דלקתי אימונו גורמי 11. מעניין לציין, כי רבים של גורמים אלה כגון פרוסטגלנדין E2 (PGE2), מגורה גורם נמק גידול גן 6 (TSG6), ואת גורם הגדילה hepatocyte (HGF) יוצרו בכמויות הרבה יותר גדול על ידי spheroids MSC מ MSCs 2D המסורתית לסלול את הדרך עבור רעיון שלבתרביות 3D כדי להפעיל את תאי 8, 12, 13. יתר על כן, הפעלת גנים בתרבויות 3D הופיע לשחזר מנגנונים, לפחות חלקית, של הפעלת תא לאחר ההזרקה לעכברים 12. על ידי הפעלת MSCs לפני השימוש בם בניסויים, אפקטים של התאים עשויים להתמשך ובולטים יותר כהשפעת MSC המסורתית in vivo היא לעתים קרובות מתעכבת וחולפת, והוא יכול להיות מתואר כמו "פגע וברח". במהלך השנים האחרונות, מחקרים תפקודיים חשובים באמצעות spheroids MSC הוכיחו כי הם יכולים לדכא תגובות דלקתיות ולווסת חסינויות in vivo באמצעות השפעה על תאי מפעיל כגון מקרופאגים, תאים דנדריטים, נויטרופילים, ותאי T ביצוע spheroids צורה אטרקטיבית של MSCs הדרוך 2 , 3. בנוסף, ייצור של מולקולות אנטי-סרטניות, כגון interleukin-24 (IL-24) ו נימקים גידול קשור גורם ליגנד וישכנע אפופטוזיס (TRAIL), גוברים בתרבויות 3D של יחסי MSCs כדי חד שכבתי MSCs, תופעה שעלולה להיות מנוצלת על בטיפולי הסרטן ממוקד 8, 10, 14.
כמו התרבות MSC המסורתית נדרשה לא רק את שימוש פלסטיק בתרבית רקמה אלא גם FBS, משוכה נוספת וגדילה ל spheroids MSC יותר נוחה לשימוש קליני היה הצורך להתגבר. כדי להתמודד עם המשוכה הזאת, הראינו היווצרות לאחרונה של spheroids MSC בתנאי XF ספציפי הגדרה כימית והקמתי כי spheroids MSC וכתוצאה מכך הופעל לייצר המולקולות אנטי-דלקתית ואנטי-הסרטניות הזהות spheroids שנוצר בתנאים עם FBS 14. הנה, ממצאים אלה מוצגים בכמה פרוטוקולים מפורטים המדגימים את הדור של MSCs מראש המופעל בתרבויות 3D באמצעות XFכְּלֵי תִקְשׁוֹרֶת. בנוסף, פרוטוקולים מוצגים המתארים דרכים יעילות כדי להעריך את רמות ההפעלה של MSCs לגבי ההשפעות אנטי דלקתית, המערכת החיסונית ואנטי סרטן שלהם, יחד עם שיטה מעשית כדי לספק את spheroids השלם לעכברים.
MSC האופטימלי לשימוש בכמה יישומי מחקר קליניים צריך להיות מופעל ביותר על מנת למקסם את התועלת שלהם, והכין מועדף בתנאי XF הגדרה כימית כדי למזער את המסירה של אנטיגנים פוטנציאל מרכיבים בינוניים xenogeneic כגון FBS. בפרוטוקולים המתוארים כאן, הראינו שיטות 1) להפעיל MSCs בתרבות 3D ידי הי…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded in part by grant P40RR17447 from the National Institute of Health and award RP150637 from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas. We would like to thank Dr. Darwin J. Prockop for his support on the project.
MEM-α (minimal essential medium alpha) | ThermoFisher/Gibco | 12561049; 12561056; 12561072 | minimal essential medium for preparation of MSC growth medium (CCM) |
FBS (fetal bovine serum), premium select | Atlanta Biologicals | S11595; S11510; S11550; S11595-24 | component of complete culture media for all types of cells |
L-glutamine | ThermoFisher/Gibco | 25030081; 25030149; 25030164 | component of complete culture media for all types of cells |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFisher/Gibco | 15070063 | component of complete culture media for all types of cells |
Sterilization Filter Units, 0.22 µm PES membrane | MilliporeSigma | SCGPU01RE; SCGPU02RE; SCGPU05RE; SCGPU10RE; SCGPU11RE | media sterilization |
150 mm cell culture dish | Nunc | D8554 SIGMA | cell culture |
Thermo Forma water-jacketed CO2 humidified incubator | Thermo Fisher | Model 3110 | incubation of cultured cells |
Early passage MCSs | Center for the preparation and Distribution of Adult Stem Cells at The Texas A&M Health Science Center College of Medicine Institute for Regenerative Medicine at Scott & White | NA | preparation of 2D and 3D cultures of MSCs |
water bath | VWR | 89501-468 | warming media to 37 °C |
Pipettes | Eppendorf | 492000904 | manual liquid handling |
Pipete-Aid | Drummond Scientific Company | 4-000-300 | handling sereological pipetes |
Costar sterile serological pipet (5, 10, 25 and 50 ml) | Corning | 4487; 4101; 4251; 4490 | liquid handling |
PBS (phosphate buffered saline), pH 7.4 | ThermoFisher/Gibco | 10010023; 10010072; 10010031; 10010049 | cell culture processing |
0.25% trypsin/EDTA solution | ThermoFisher/Gibco | 25200056; 25200072; 25200114 | lifting adherent cells and dispersing cell aggregates |
15 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352097 | cell centrifugation |
50 ml conical tube | Corning/BD Falcon | 352098 | cell centrifugation |
Eppendor refrigerated centrifuge | Eppendorf/Fisher Scientific | Model 5810R | cell centrifugation |
hemocytometer | Fisher Scientific | 26716 | cell counting |
trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 SIGMA | dead cell exclusion during cell counting in hemacytometer |
Defined xenofree MSC medium-1 (XFM-1) | ThermoFisher/Gibco | A1067501 | Xeno-free media specifically formulated for the growth and expansion of human mesenchymal stem cells |
Defined xenofree MSC medium-2 (XFM-2) | Stem Cell Technologies | 5420 | Defined, xeno-free medium for human mesenchymal stem cells |
HSA (Human serum albumin) | Gemini | 800-120 | Component of xeno-free MSC media |
rHSA (recombinant Human serum albumin) | Sigma-Aldrich | A9731 SIGMA | Component of xeno-free MSC media |
8-channel pipette, 10 – 100 µL | Eppendorf | 022453904 | preparation of hanging drops |
Total RNA isolation Mini Kit | Qiagen | 74104 | Total RNA extraction |
Qiashredder | Qiagen | 79654 | Sample homogenization prior to total RNA extraction |
RNAse-free DNase Set | Qiagen | 79254 | On-column DNA elimination during total RNA extraction |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 ALDRICH | inhibition of RNAses in RLT buffer |
Vortex | VWR | 97043-562 | mixing sample |
Spectrophotometer | Biorad | NA | RNA concentration and quality |
High capacity cDNA Reverse Transcription Kit | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4368814 | transcription of total RNA into cDNA |
Gene Expression Assays | ThermoFisher/Applied Biosystems | varies | primer/probe combination for real-time PCR |
Fast Universal PCR Master Mix | ThermoFisher/Applied Biosystems | 4352042; 4364103; 4366073; 4367846 | master mix for real-time PCR reaction |
Real-time PCR system (ABI Prism 7900 HT Sequence Detection System) | ABI Prizm | NA | real-time PCR |
1.5 ml centrifuge tube | Eppendorf | 22364111 | cell centrifugation, sample collection and storage |
(-80°C) freezer | Thermo Fisher | Model Thermo Forma 8695 | sample storage |
PGE2 (Prostaglandin E2) ELISA Kit | R&D Systems | KGE004B | estimation of cytokine concentration in the sample |
DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) | ThermoFisher/Gibco | 10566-016; 10566-024;10566-032 | macrophage culture media |
J774 mouse macrophages | ATCC | TIB-67 | mouse macrophage cell line |
12-well plate | Corning | 3513 | in-vitro macrophage stimulation |
LPS (lipopolysaccharide) | Sigma-aldrich | L4130 | in vitro macrophage stimulation |
Mouse TNF-a ELISA kit | R&D Systems | MTA00B | estimation of cytokine concentration in the sample |
Mouse IL-10 (interleukin 10) ELISA kit | R&D Systems | M1000B | estimation of cytokine concentration in the sample |
RPMI-1640 medium | ThermoFisher/Gibco | 11875-085 | splenocyte culture media |
BALB/c mice | The Jackson Laboratory | 651 | in vivo spheroid delivery; splenocyte preparation |
Anti-Mouse CD3e Functional Grade Purified | eBioscience | 145-2C11 | In vitro splenocyte stimulation |
70 μm strainer | Corning | 352350 | Splenocyte preparation |
Red blood cell lysis solution (1x) | Affymetrix eBioscience | 00-4333 | removal of red blood cells during splenocyte isolation |
Mouse IFN-y (interferon gamma) ELISA kit | R&D Systems | MIF 00 | estimation of cytokine concentration in the sample |
LNCaP prostate cancer cells | ATCC | CRL-1740 | study the effect of 3D MSCs on cancer cell lines in vitro |
DNA-based cell proliferation assay kit | ThermoFisher | C7026 | cell number measurement based on DNA content |
NaCl | Sigma-Aldrich | S5150 | component of lysis reagent |
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | ThermoFisher | FERR1021 | calcium chelator, component of lysis reagent |
Rnase A | Qiagen | 19101 | RNA degradation for measurement of DNA |
Filter-based multi-mode microplate reader | BMG Technology | NA | Microplate assays (ELISA, cell quantification, e.t.c.) |
HBSS (Hanks balanced salt solution), no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher/Gibco | 14175079 | resupsension of MSC spheroids prior to in vivo injections |
Isoflurane | MWI Vet Supply | 502017 | Anesthesia for in vivo injections |
Oxygen, compressed gas | Praxair | NA | For use with isoflurane |
Thermo Forma BSL-2 cabinet | Thermo Fisher | Model 1385 | Sterile cell culture |
Safety I.V. catheter/needle stiletto, 20G, 1 inch | Terumo | SR*FNP2025 | Delivery of shperoids into peritoneal cavity |
Sterile micropipette tips | Eppendorf | varies | liquid/cells handling |