Summary

シンプルの力:ウニ胚として<em> in vivoで</em>複雑な細胞間シグナル伝達ネットワークの相互作用を研究するための発達モデル

Published: February 16, 2017
doi:

Summary

このビデオの記事では、体系的かつ効率的に多くの無脊椎動物の胚では、複雑なシグナル伝達経路および制御ネットワークの構成要素を特徴付けるために使用することができるin vivoでの方法論簡単な詳細を示します。

Abstract

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introduction

遺伝子制御ネットワーク(GRNs)とシグナル伝達経路は、成体動物の体の計画を構築するために使用される胚発生の間の遺伝子の空間的および時間的発現を確立します。細胞から細胞へのシグナル伝達経路は、細胞が通信する手段を提供し、これらの調節ネットワークの重要な構成要素です。これらの細胞の相互作用は、胚発生1、2中の様々な地域でとの間の規制および分化遺伝子の発現を確立し、改良します。分泌された細胞外調節因子(リガンド、アンタゴニスト)、受容体および共受容体の間の相互作用は、シグナル伝達経路の活性を制御します。細胞内分子の品揃えは、遺伝子発現の変化、分割、および/または細胞の形で得られたこれらの入力を伝達します。主要な経路で細胞外および細胞内のレベルで使用する鍵分子の多くがあるが既知の、個々のシグナル伝達経路の複雑さに大部分の不完全な知識です。加えて、異なるシグナル伝達経路は、多くの場合、細胞外、細胞内での正または負のいずれかで互いに相互作用し、転写レベル3、4、5、6。重要なことには、シグナル伝達経路のコアコンポーネントは、非常にすべての後生動物種で保存され、特に密接に関連門の生物を比較する場合、著しく、主要なシグナル伝達経路の大部分は、多くの場合、多くの種において類似の発達機能を実行7、8、9、 10、11。

開発中にシグナル伝達の研究では、任意の生物で困難な作業であり、そしてそこに脊椎動物では、大きな可能性リガンドと受容体/共変調器の相互作用の数、細胞内伝達分子、ならびにがあります1):ほとんどの新口動物モデル(脊椎動物、無脊椎動物脊索動物、半索動物、および棘皮動物)でシグナル伝達経路を研究するためのいくつかの重要な課題がありますゲノム12の複雑さに起因する異なるシグナル伝達経路の間の潜在的な相互作用、13、14; 2)脊椎動物の複雑な形態および形態形成の動きは、多くの場合、それはより困難でかつシグナル伝達経路間の機能的相互作用を解釈することを可能にします。 3)ほとんどの非棘皮動物無脊椎動物の新口動物モデル種における分析は、いくつかのホヤ種15、16を除いて妊娠の短いウィンドウによって制限されています。

ザウニ胚は、上記制限のいくつかを持っており、 生体内でのシグナル伝達経路の詳細な分析を行うために多くのユニークな資質を提供しています。これらは、以下のものが挙げられる:1)ウニゲノムの相対的なシンプルさが大幅に可能なリガンド、受容体/共受容体と細胞内伝達分子の数を減少させる17の相互対話します。 2)胚葉および主要な胚軸の仕様およびパターニングを制御GRNsはよく信号18、19セル受信/地域の規制状況の理解を助ける、ウニ胚で確立されています。胚は、その形態を分析するのが容易である単層上皮で構成されたとき3)多くのシグナル伝達経路は、早期に切断し、原腸ステージ間で研究することができます。 4)分子が関与しますウニ内シグナル伝達経路中のdは、容易に操作されています。 5)多くウニは、10〜11ヶ月〜1年( 例えばStrongylocentrotusのpurpuratusLytechinusのvariegatus)のために妊娠しています。

ここでは、体系的かつ効率的に指定し、ウニ胚のパターン領土は、いくつかの無脊椎動物モデル系が複雑な分子メカニズムの研究に提供する利点を説明するためにシグナル伝達経路の構成要素を特徴づけるための方法を提示します。

Protocol

1.高スループットモルホリノデザイン戦略目的の遺伝子(複数可)( 例えば 、候補遺伝子アプローチ、シス調節分析、RNAseqおよび/またはプロテオミクス差動画面)を特定します。 頻繁に更新されるウェブサイト上で利用可能なゲノム、トランスクリプトーム、および遺伝子発現データを使用してください( 例えば SpBase http://www.echinobase.org 20と<…

Representative Results

ウニ胚では、3つの異なるWntシグナル支店(のWnt /βカテニンは、Wnt / JNK、およびWnt / PKC)4、25相互作用は前後(AP)パターニングを支配するWntシグナル伝達ネットワークを形成することが示されています。これらのシグナル伝達イベントの中で最も重要な結果の一つは、初期広く発現し、前方神経外胚葉(ANE)GRNは、原腸形?…

Discussion

ここで紹介する方法は..多くのラボが分析する早期ウニ開発時に同様のアッセイを使用している基本的な発達のメカニズムを支配するシグナル伝達経路とGRNsを理解するために、脊椎動物未満ゲノムおよび形態学的な複雑さに胚を使用してのパワーを示している例です。他の細胞運命指定イベント( 例えば、ノッチ、ヘッジホッグ、TGF-βの、及びFGFシグナリング)に関与する経路<sup clas…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Dr. Robert Angerer for his careful reading and editing of the manuscript. NIH R15HD088272-01 as well as the Office of Research and Development, and Department of Biological Sciences at Mississippi State University provided support for this project to RCR.

Materials

Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino Gene Tools LLC Customized More information at www.gene-tools.com
Glycerol Invitrogen 15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) Invitrogen, Life Technologies D1821 Make 25mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
MOPS Sigma Aldrich M1254-250G
Tween-20 Sigma Aldrich 23336-0010
Formamide Sigma Aldrich 47671-1L-F
Yeast tRNA Invitrogen 15401-029
Normal Goat Serum Sigma Aldrich G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody Roche 11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole) Sigma Aldrich L9756-5G
Tris Base UltraPure Research Products Internationall Corp 56-40-6
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Magnesium chloride Sigma Aldrich 7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate Roche 11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) Roche 11 383 213 001
Dimethyl Formamide Sigma Aldrich D4551-500mL
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541-5KG
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761-500G
Magnesium Sulfate Sigma Aldrich M7506-2KG
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016-500G

References

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

Play Video

Cite This Article
Range, R. C., Martinez-Bartolomé, M., Burr, S. D. The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions. J. Vis. Exp. (120), e55113, doi:10.3791/55113 (2017).

View Video