Summary

כוחה של פשטות: עובר קיפוד ים כמו<em> ב Vivo</em> מודלים התפתחותי לימוד Cell ל-תא קומפלקס אינטראקציות רשת איתות

Published: February 16, 2017
doi:

Summary

במאמר זה וידאו מפרט פשוטה במתודולוגיה vivo, שניתן להשתמש בהם כדי בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות מורכבות ורשתות רגולטוריות בעוברים חסרי חוליות רבים.

Abstract

Remarkably few cell-to-cell signal transduction pathways are necessary during embryonic development to generate the large variety of cell types and tissues in the adult body form. Yet, each year more components of individual signaling pathways are discovered, and studies indicate that depending on the context there is significant cross-talk among most of these pathways. This complexity makes studying cell-to-cell signaling in any in vivo developmental model system a difficult task. In addition, efficient functional analyses are required to characterize molecules associated with signaling pathways identified from the large data sets generated by next generation differential screens. Here, we illustrate a straightforward method to efficiently identify components of signal transduction pathways governing cell fate and axis specification in sea urchin embryos. The genomic and morphological simplicity of embryos similar to those of the sea urchin make them powerful in vivo developmental models for understanding complex signaling interactions. The methodology described here can be used as a template for identifying novel signal transduction molecules in individual pathways as well as the interactions among the molecules in the various pathways in many other organisms.

Introduction

ג'ין רשתות רגולטוריות (GRNs) ואת מסלולי העברת אותות להקים הביטוי במרחב ובזמן של גנים במהלך ההתפתחות העוברית המשמשים לבניית תוכנית גוף החיה הבוגרת. תא אל תא מסלולי העברת אותות הם מרכיבים חיוניים של רשתות רגולטוריות אלו, מתן הכלי שבאמצעותו תאים מתקשרים. אינטראקציות הסלולר אלה להקים ולשפר את הביטוי של גני רגולטוריים והבחינו ובקרב בשטחים השונים במהלך embryogenesis 1, 2. אינטראקציות בין מאפננים תאיים מופרשים (הליגנדים, אנטגוניסטים), קולטנים, ו-קולטנים שיתוף לשלוט על פעילות מסלולי העברת אותות. מבחר של מולקולות תאיות transduces תשומות אלה וכתוצאה מכך ביטוי גנים שהשתנה, חלוקה, ו / או צורה של תא. בעוד רבים של מולקולות המפתח בשימוש ברמות התאיות ו תאי על המסלולים העיקריים הםידוע, הוא ידע שלם נובע במידה רבה למורכבות של מסלולי איתות בודדים. בנוסף, מסלולי איתות שונים לעתים קרובות אינטראקציה זה עם זה חיובי או שלילי על התאים, תאיים, ורמות תעתיק 3, 4, 5, 6. חשוב לציין, מרכיבי הליבה של מסלולי העברת אותות הם שמורים ביותר בכל המינים מטזואניים, ו, להפליא, רוב מסלולי איתות הגדולים לעתים קרובות לבצע פונקציות התפתחותי דומות במינים רבים כאשר משווים אורגניזמים טווח מערכת קשור קשר הדוק בפרט 7, 8, 9, 10, 11.

המחקר של איתות במהלך ההתפתחות הוא משימה מרתיעה בכל אורגניזם, וישכמה אתגרים משמעותיים ללימוד מסלולי איתות במודלים השניוניים הפה ביותר (בעלי חוליות, המיתרנים חסרי חוליות, hemichordates, ו echinoderms): 1) בקרב בעלי חוליות יש מספר גדול של ליגנד האפשרי ואינטראקציות קולטן / אפנן-שיתוף, מולקולות התמרה תאיות, כמו גם אינטראקציות פוטנציאליות בין נתיבים שונים מאותתים בשל המורכבות של הגנום 12, 13, 14; 2) המורפולוגיה המורכבת ותנועות המוךפו"גנטי שהולכות חוליות לעתים קרובות לעשות את זה יותר קשה לפרש אינטראקציות תפקודיות ובקרב מסלולי העברת אותות; 3) ניתוח ברוב מיני מודל שאינו קווצי עור חסר חוליות שניוניות פה מוגבל על ידי חלון קצר gravidity למעט כמה מיני מיתרני זנב 15, 16.

העובר ים קיפוד יש כמה מן המגבלות הנ"ל ומציע איכויות ייחודיות רבות לביצוע ניתוח מפורט של מסלולי העברת אותות in vivo. אלה כוללים את הבאים: 1) הפשטות היחסית של הגנום קיפוד הים מפחית באופן משמעותי את המספר ליגנד אפשרי, קולטן / שיתוף הקולטן מולקולת התמרה תאית קשרי גומלין 17; 2) GRNs שליטה במפרט הדפוסים של השכבות הניבטות וגרזנים עובריים עיקריים מבוססות היטב בעוברי קיפוד ים, בסיוע להבנת ההקשר רגולטוריות של התא / טריטורית קבלת האותות 18, 19; 3) מסלולי העברת אותות רבים ניתן ללמוד בין שלבי מחשוף gastrula מוקדם כאשר עוברים מורכבת של האפיתל שכבתית יחידה מורפולוגיה אשר קל יותר לנתח; 4) המולקולות לערבד ב מסלולי איתות של קיפודי הים הם מניפולציה בקלות; 5) קיפודי ים רבים המעוברים במשך 10 עד 11 חודשים בשנה (למשל Strongylocentrotus purpuratus ו Lytechinus variegatus).

כאן, אנו מציגים שיטה בשיטתיות וביעילות לאפיין מרכיבי מסלולי איתות המציינים וטריטוריות דפוס בעוברי קיפוד ים כדי להמחיש את היתרונות כי מספר מערכות מודל חסרות חוליות להציע בחקר מנגנונים מולקולריים מורכבים.

Protocol

1. עיצוב אסטרטגית Morpholino תפוקה גבוהה לזהות גן (ים) של עניין (גישת הגן המועמד למשל, ניתוח הרגולציה ציס, RNA-seq ו / או מסכי ההפרש proteomic). השתמש גנומית, transcriptomic, ונתוני ביטוי גנים באתרים מתעדכנים ב…

Representative Results

בעובר הים קיפוד הראינו כי 3 איתות סניפים Wnt שונים (Wnt / β-קטנין, Wnt / JNK, ו Wnt / PKC) 4, 25 פועלים יחד כדי ליצור רשת איתות Wnt השולט הקדמי-אחורי דפוסים (AP). אחת התוצאות החשובות ביותר של אירועי איתות אלה היא כי קדמי neuroectoderm רחב הביע הר?…

Discussion

המתודולוגיה המוצגת כאן היא דוגמא שממחישה את הכח של שימוש בעוברים עם מורכבות גנומית וצורניות פחות חוליות להבין את מסלולי העברת איתות GRNs המסדירים מנגנוני התפתחותיים יסוד .. מעבדות רבות משתמשות מבחנים דומים במהלך התפתחות קיפוד הים מוקדם לנתח את מסלולי איתות מעורבים בא…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank Dr. Robert Angerer for his careful reading and editing of the manuscript. NIH R15HD088272-01 as well as the Office of Research and Development, and Department of Biological Sciences at Mississippi State University provided support for this project to RCR.

Materials

Translational-blocking morpholino and/or splice-blocking morpholino Gene Tools LLC Customized More information at www.gene-tools.com
Glycerol Invitrogen 15514-011
FITC (dextran fluorescein isothiocyanate) Invitrogen, Life Technologies D1821 Make 25mg/mL stock solution
Paraformaldehyde 16% solution EM Grade Electron Microscopy Sciences 15710
MOPS Sigma Aldrich M1254-250G
Tween-20 Sigma Aldrich 23336-0010
Formamide Sigma Aldrich 47671-1L-F
Yeast tRNA Invitrogen 15401-029
Normal Goat Serum Sigma Aldrich G9023-10mL
Alkaline Phosphatase-conjugated anti-digoxigenin antibody Roche 11 093 274 910
Tetramisole hydrochloride (levamisole) Sigma Aldrich L9756-5G
Tris Base UltraPure Research Products Internationall Corp 56-40-6
Sodium Chloride Fisher Scientific BP358-10
Magnesium chloride Sigma Aldrich 7786-30-3
BCIP (5-Bromo-4-Chloro-3-indolyl-phosphate Roche 11 383 221 001
4 Nitro blue tetrazolium chloride (NBT) Roche 11 383 213 001
Dimethyl Formamide Sigma Aldrich D4551-500mL
Potassium Chloride Sigma Aldrich P9541-5KG
Sodium Bicarbonate Sigma Aldrich S5761-500G
Magnesium Sulfate Sigma Aldrich M7506-2KG
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016-500G

References

  1. Erwin, D. H., Davidson, E. H. The evolution of hierarchical gene regulatory networks. Nature reviews. Genetics. 10, 141-148 (2009).
  2. Peter, I. S., Davidson, E. H. Evolution of gene regulatory networks controlling body plan development. Cell. 144, 970-985 (2011).
  3. Borggrefe, T., et al. The Notch intracellular domain integrates signals from Wnt, Hedgehog, TGFbeta/BMP and hypoxia pathways. Biochimica et biophysica acta. 1863, 303-313 (2016).
  4. Range, R. C., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Integration of canonical and noncanonical Wnt signaling pathways patterns the neuroectoderm along the anterior-posterior axis of sea urchin embryos. PLoS Biol. 11, e1001467 (2013).
  5. Cleary, M. A., van Osch, G. J., Brama, P. A., Hellingman, C. A., Narcisi, R. FGF, TGFbeta and Wnt crosstalk: embryonic to in vitro cartilage development from mesenchymal stem cells. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 9, 332-342 (2015).
  6. Lapraz, F., et al. RTK and TGF-beta signaling pathways genes in the sea urchin genome. Dev Biol. 300, 132-152 (2006).
  7. Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. The evolution of signalling pathways in animal development. Nature reviews. Genetics. 4, 39-49 (2003).
  8. Sethi, A. J., Wikramanayake, R. M., Angerer, R. C., Range, R. C., Angerer, L. M. Sequential signaling crosstalk regulates endomesoderm segregation in sea urchin embryos. Science. 335, 590-593 (2012).
  9. Range, R. Specification and positioning of the anterior neuroectoderm in deuterostome embryos. Genesis. 52, 222-234 (2014).
  10. Petersen, C. P., Reddien, P. W. Wnt signaling and the polarity of the primary body axis. Cell. 139, 1056-1068 (2009).
  11. Lapraz, F., Haillot, E., Lepage, T. A deuterostome origin of the Spemann organiser suggested by Nodal and ADMPs functions in Echinoderms. Nature communications. 6, 8434 (2015).
  12. Kikuchi, A., Yamamoto, H., Sato, A. Selective activation mechanisms of Wnt signaling pathways. Trends in cell biology. 19, 119-129 (2009).
  13. Hogan, B. L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development. Genes Dev. 10, 1580-1594 (1996).
  14. Houart, C., et al. Establishment of the telencephalon during gastrulation by local antagonism of Wnt signaling. Neuron. 35, 255-265 (2002).
  15. Bertrand, S., Escriva, H. Evolutionary crossroads in developmental biology: amphioxus. Development. 138, 4819-4830 (2011).
  16. Rottinger, E., Lowe, C. J. Evolutionary crossroads in developmental biology: hemichordates. Development. 139, 2463-2475 (2012).
  17. Genome Sequencing Sea Urchin, C., et al. The genome of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus. Science. 314, 941-952 (2006).
  18. Ben-Tabou de-Leon, S., Su, Y. H., Lin, K. T., Li, E., Davidson, E. H. Gene regulatory control in the sea urchin aboral ectoderm: spatial initiation, signaling inputs, and cell fate lockdown. Dev Biol. 374, 245-254 (2013).
  19. Saudemont, A., et al. Ancestral regulatory circuits governing ectoderm patterning downstream of Nodal and BMP2/4 revealed by gene regulatory network analysis in an echinoderm. PLoS Genet. 6, e1001259 (2010).
  20. Cameron, R. A., Samanta, M., Yuan, A., He, D., Davidson, E. SpBase: the sea urchin genome database and web site. Nucleic Acids Res. 37, D750-D754 (2009).
  21. Stepicheva, N. A., Song, J. L. High throughput microinjections of sea urchin zygotes. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50841 (2014).
  22. Cheers, M. S., Ettensohn, C. A. Rapid microinjection of fertilized eggs. Methods in cell biology. 74, 287-310 (2004).
  23. Arenas-Mena, C., Cameron, A. R., Davidson, E. H. Spatial expression of Hox cluster genes in the ontogeny of a sea urchin. Development. , 4631-4643 (2000).
  24. Sethi, A. J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. Multicolor labeling in developmental gene regulatory network analysis. Methods in molecular biology. , 249-262 (2014).
  25. Wikramanayake, A. H., Huang, L., Klein, W. H. beta-Catenin is essential for patterning the maternally specified animal-vegetal axis in the sea urchin embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 9343 (1998).
  26. Yaguchi, S., Yaguchi, J., Angerer, R. C., Angerer, L. M. A Wnt-FoxQ2-nodal pathway links primary and secondary axis specification in sea urchin embryos. Dev Cell. 14, 97-107 (2008).
  27. Molina, M. D., de Croze, N., Haillot, E., Lepage, T. Nodal: master and commander of the dorsal-ventral and left-right axes in the sea urchin embryo. Curr Opin Genet Dev. 23, 445-453 (2013).
  28. Range, R. C., Glenn, T. D., Miranda, E., McClay, D. R. LvNumb works synergistically with Notch signaling to specify non-skeletal mesoderm cells in the sea urchin embryo. Development. 135, 2445-2454 (2008).
  29. Range, R., et al. Cis-regulatory analysis of nodal and maternal control of dorsal-ventral axis formation by Univin, a TGF-beta related to Vg1. Development. 134, 3649-3664 (2007).
  30. Warner, J. F., Miranda, E. L., McClay, D. R. Contribution of hedgehog signaling to the establishment of left-right asymmetry in the sea urchin. Dev Biol. 411, 314-324 (2016).
  31. Rottinger, E., et al. FGF signals guide migration of mesenchymal cells, control skeletal morphogenesis [corrected] and regulate gastrulation during sea urchin development. Development. 135, 353-365 (2008).
  32. Warner, J. F., McCarthy, A. M., Morris, R. L., McClay, D. R. Hedgehog signaling requires motile cilia in the sea urchin. Mol Biol Evol. 31, 18-22 (2014).
  33. Technau, U., Steele, R. E. Evolutionary crossroads in developmental biology. Cnidaria. Development. 138, 1447-1458 (2011).
  34. Yaguchi, J., Takeda, N., Inaba, K., Yaguchi, S. Cooperative Wnt-Nodal Signals Regulate the Patterning of Anterior Neuroectoderm. PLoS Genet. 12, e1006001 (2016).
  35. Duboc, V., Rottinger, E., Besnardeau, L., Lepage, T. Nodal and BMP2/4 signaling organizes the oral-aboral axis of the sea urchin embryo. Dev Cell. 6, 397-410 (2004).
  36. Bradham, C. A., et al. Chordin is required for neural but not axial development in sea urchin embryos. Dev Biol. 328, 221-233 (2009).
  37. Su, Y. H. Gene regulatory networks for ectoderm specification in sea urchin embryos. Biochimica et biophysica acta. 1789, 261-267 (2009).
  38. Lin, C. Y., Su, Y. H. Genome editing in sea urchin embryos by using a CRISPR/Cas9 system. Dev Biol. 409, 420-428 (2016).

Play Video

Cite This Article
Range, R. C., Martinez-Bartolomé, M., Burr, S. D. The Power of Simplicity: Sea Urchin Embryos as in Vivo Developmental Models for Studying Complex Cell-to-cell Signaling Network Interactions. J. Vis. Exp. (120), e55113, doi:10.3791/55113 (2017).

View Video