Dextran fare ve insan birincil NK hücreleri Lentiviral iletim verimliliğini artırır
Summary
Bu çalışmanın amacı hücrelerdeki birincil doğal öldürücü (NK) başarılı gen iletim için izin teknolojileri formüle etmek oldu. İnsan lentiviral iletim dextran aracılı veya fare birincil NK hücreleri sonuçlarında yüksek gen ifade verimliliği. Bu yöntemi, gen iletim NK hücre genetik manipülasyon büyük ölçüde artıracaktır.
Abstract
Doğal öldürücü (NK) hücreye belirli genlerin iletim verimli büyük bir mücadele vardı. Başarılı transductions geliştirme, farklılaşma ve NK hücreleri fonksiyon ilgi gen rolü tanımlamak için kritik öneme sahiptir. Kanserli hastalarda chimeric antijen reseptör (CARs) ile ilgili son gelişmeler eksojen genler efektör lenfositler için teslim etmek etkili bir yöntem ihtiyacını vurgular. Lentiviral-aracılı gen transductions birincil insan veya fare NK hücreleri içine verimliliği önemli kısıtlayıcı bir faktör olduğu önemli ölçüde düşük kalır. Son gelişmeler polybrene gibi Katyonik polimerler kullanılarak geliştirilmiş gen iletim verimliliği T hücreleri gösterir. Ancak, bu ürünlerin NK hücreleri iletim verimliliği artırmak başarısız oldu. Bu iş o dextran dallı glukan polisakkarit gösterir önemli ölçüde iletim insan ve fare birincil NK hücreleri artırır. Bu son derece tekrarlanabilir iletim yöntemi klinik gen teslim uygulamalar ve böylece NK hücre tabanlı kanserli hastalarda. büyük ölçüde artırabilirsiniz insan birincil NK hücreleri transducing için yetkili bir araç sağlar
Introduction
Doğal öldürücü (NK) doğuştan gelen bağışıklık sistemi1büyük lenfositik nüfusu hücrelerdir. NK hücreleri karşı tümörler ve enfeksiyonlar2,3,4ana bilgisayar bağışıklık yanıtının ilk satır savunucuları olarak işlev. NK hücreleri de güçlü sitokinler ve kemokinler5salgılanmasını aracılığıyla tolerans gelişimi merkezi bir rol oynamaktadır. Hedef ve tümör hücreleri ortadan kaldırmak için güçlü yeteneklerini nedeniyle, donör elde edilen insan NK hücreleri kanser6,7için bir adoptive immünoterapi olarak değerlendirmek için birden fazla klinik çalışmalar yürütülmektedir. Aksine T hücreler, NK hücreleri gelişim biyolojisi henüz iyi karakterize8olmak zorundadır. Bu bilgi kısmen genler ilgi fare veya insan birincil NK hücreleri göndermek verimli teknikleri yokluğu nedeniyle eksikliğidir. Bu nedenlerden dolayı hücre hatları yerine Primer hücre en NK hücre çalışmaları yapılmıştır. Bu nedenle, birincil NK hücreleri genler ilgi ile transduce güvenilir ve etkin bir iletişim kuralı için ihtiyaç çok önemlidir.
Bu çalışmada genel amacı lenti – veya Retrovirüsler birincil insan veya fare NK hücreleri transduced tutarlı ve güvenilir bir yöntem formüle etmek oldu.
Büyük ölçüde birincil NK hücreleri geçici dönüşümü kullanarak bu sorunu çözmeye çalıştığınız önceki çalışmalar yapılmıştır. Bu plazmid transfection9,10, Epstein – Barr virüsü (EBV) içerir / retroviral hibrid vektör11, vaksinia vektörler12,13ve14Ad5/F35 chimeric adenoviral vektörel çizimler. Bu teknikler mütevazı verimliliğini rağmen iletim geçici doğasını onlara genetiği değiştirilmiş NK hücreleri uzun süreli kullanımı için uygun olmayan hale getirir. Bir kaç son yıllarda yapılan çalışmalarda retroviral vektörler NK hücreleri, enfeksiyon gen ifade11,15kabul edilebilir bir düzeyde sağlamak için birden fazla döngüleri gerektiren transduce için kullandık. Retroviral vektörler aksine, lentiviral vektörler konak hücre nükleer alma makine viral öncesi entegrasyonu karmaşık çekirdek translocate için kullanabilirsiniz. Bu virüs birincil NK hücreleri dahil olmayan bölme hücrelerdeki çoğaltma büyük bir sınırlayıcı faktördür.
Farklı hücre yüzey reseptörleri ve viral parçacıkların arasındaki etkileşimler viral alımını hücre içine izin verir. Viral zarf proteinleri ve onların soydaş ana bilgisayar reseptörleri arasındaki ilk nişan bu iki arasında mevcut potansiyel negatif ücretleri nedeniyle sınırlı olabilir. Polybrene (Pb), protamine sülfat (PS) veya dextran, gibi Katyonik polimerler ek hücre yüzey reseptörleri için olumlu bir ücret vermek ve böylece viral zarf bağlama çoğaltmak birçok iletim teknikleri arkasındaki mantığı olduğunu proteinler. Bu hücreler16tarafından füzyon verimlilik ve viral parçacıkların alımını artırır. Her ne kadar Türkçe veya PS gen transferi T hücreleri17artırabilir rapor edildi, bunların uygulama birincil NK hücreleri iletim verimliliği herhangi bir etkisi yoktu. Ayrıca, birincil NK hücreleri kullanarak bu Ayıraçlar arasında karşılaştırmalı bir analiz gerçekleştirilmedi. Bu çalışmada, üç Katyonik polimerler iletim verimliliği karşılaştırıldı. Bu üç Katyonik polimerler arasında sadece dextran önemli fare ve insan birincil NK hücreleri içine etkili viral iletim artırır, sonuçlar gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Katyonik polimer Ajan fare ve insan birincil NK hücreleri lentiviral iletim verimliliğini artırır gibi bu çalışmada dextran o kullanımını gösterir. Ayrıca, Türkçe veya PS, gibi Katyonik diğer ajanlar insan birincil NK hücreleri viral vektörler teslimini üzerinde fark edilebilir bir etkisi olması. Daha önce Türkçe insan T hücreleri17gen iletim çoğaltmak olabilir kanıtlanmıştır. Bu sonuçlar, ancak, ne Türkçe ne de PS benzer bir verimlilik insan birincil NK hücreleri …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lucia Sammarco ve onun Lulu’nun limonata standı ilham, motivasyon ve destek için teşekkür ederiz. Bu eser kısmen NIH R01 AI102893 ve ncı R01 CA179363 (S.M.) tarafından desteklenmiştir; NHLBI-HL087951 (S.R.); NIH-CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); Alex Lemonade Stand Vakfı (S.M.); HRHM Program MACC Fonu (S.M.; S.R.; M.S.T); Nicholas Aile Vakfı (S.M.); Gardetto ailesi (S.M.); Hyundai bilim adamları (M.S.T.) programı; Hyundai umut gezici (S.R.); MACC Fonu (M.S.T. ve S.M.); Çocuk Araştırma Enstitüsü, MCW (S.R.); ve Kathy Duffey Fogerty Ödülü (M.J.R.).
Materials
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
References
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
- Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
- Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
- Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
- Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95 (2014).
- Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94 (2016).
- Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
- Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
- Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
- Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
- Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
- Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
- Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
- Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
- Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
- Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529 (2009).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
- Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
- Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
- Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
- Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
- Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).
