Dextrane augmente l’efficacité de la Transduction des gènes des cellules NK primaires murines et humaines
Summary
L’objectif de cette étude était de formuler des technologies permettant la transduction réussie de gène dans les cellules primaires de le natural killer (NK). L’induite par le dextran de transduction des gènes de l’homme ou les résultats de cellules NK primaires de souris à une efficacité accrue les expression de gène. Cette méthode de transduction gène améliorera la manipulation génétique de cellules NK.
Abstract
La transduction efficace de gènes spécifiques dans les cellules tueuses naturelles de (NK) a été un défi majeur. Transductions réussies sont essentielles pour définir le rôle du gène d’intérêt dans le développement, la différenciation et la fonction des cellules NK. Avances récentes relies aux récepteurs d’antigènes chimérique (RAC) en immunothérapie contre le cancer accentuent la nécessité d’une méthode efficace livrer des gènes exogènes aux lymphocytes effecteurs. Les efficacités de transductions génique par l’intermédiaire des gènes humains primaires ou cellules NK souris restent très faibles, qui est un facteur limitatif important. Les avancées récentes à l’aide de polymères cationiques, comme polybrene, montrent une efficacité de transduction amélioration génétique dans les cellules T. Toutefois, ces produits n’a pas à améliorer l’efficacité de la transduction des cellules NK. Ce travail montre que dextran, un polysaccharide de glucane ramifié, améliore considérablement l’efficacité de la transduction de l’homme et les cellules NK primaires de souris. Cette méthodologie de transduction hautement reproductible fournit un outil compétent pour transduction primaire NK les cellules humaines, qui peuvent améliorer considérablement les demandes de livraison de génétique clinique et donc d’immunothérapie des cancers basés sur les cellules NK.
Introduction
Natural killer (NK) cellules sont la population lymphocytaire majeure du système immunitaire inné1. Les cellules NK fonctionnent comme les défenseurs de la première ligne de la réponse immunitaire hôte contre infections et tumeurs2,3,4. Les cellules NK jouent également un rôle central dans le développement de la tolérance par le biais de la sécrétion de cytokines puissant et chimiokines5. En raison de leur puissante capacité à cibler et éliminer les cellules tumorales, plusieurs essais cliniques sont en cours pour évaluer le dérivé donneur de cellules NK humaines comme une immunothérapie adoptive pour cancer6,7. Contrairement aux cellules T, la biologie du développement des cellules NK doit encore être bien caractérisés8. Cette ignorance est partiellement due à l’absence de techniques efficaces qui offrent des gènes d’intérêt à la souris ou les cellules primaires humaines de NK. Pour ces raisons, la plupart des études de NK-cellule ont été menées dans des lignées cellulaires, plutôt que dans les cellules primaires. Par conséquent, la nécessité d’un protocole fiable et efficace transmettre des cellules NK primaires avec des gènes d’intérêt est cruciale.
L’objectif général de cette étude était de formuler une méthode cohérente et fiable par lequel des cellules primaires humaines ou murins NK pourraient être transduites avec lenti – ou rétrovirus.
Des études antérieures qui a tenté de remédier à ce problème ont été réalisées, dans une large mesure à l’aide de la transformation passagère des cellules NK primaires. Cela inclut le plasmide transfection9,10, Virus Epstein – Barr (EBV) / hybride retroviral vector11, Vaccine vecteurs12,13et Ad5/F35 chimérique vecteurs adénoviraux14. Malgré l’efficacité modeste de ces techniques, la nature transitoire de la transduction les rend impropres à l’utilisation à long terme des cellules NK génétiquement modifiés. Quelques études récentes ont utilisé des vecteurs rétroviraux pour transmettre les cellules NK, nécessitant plusieurs cycles d’infection pour atteindre un niveau acceptable de gene expression11,15. Contrairement aux vecteurs rétroviraux, vecteurs LENTIVIRAUX peuvent utiliser machinery import nucléaire cellule hôte de translocation complexe viral avant intégration dans le noyau. Il s’agit d’un facteur limitatif important dans la réplication du virus dans les cellules non-divisant, incluent des cellules NK primaires.
Interactions entre les différents récepteurs de surface cellulaire et particules virales permettent absorption virale dans la cellule. Les engagements initiaux entre les protéines de l’enveloppe virale et leurs récepteurs apparentés hôte pourraient être limitées en raison des charges négatives potentielles existant entre ces deux. La raison d’être de nombreuses techniques de transduction est que l’ajout de polymères cationiques, comme polybrene (Pb), du sulfate de protamine (PS) ou dextran, pourrait donner une charge positive sur les récepteurs de surface cellulaire et ainsi augmenter la fixation de l’enveloppe virale protéines. Cela augmentera l’efficacité de la fusion et l’absorption des particules virales par les cellules16. Bien qu’il ait été rapporté que Pb ou PS peut améliorer de transfert de gènes dans les cellules de T17, leur application n’avait aucun effet à l’efficacité de la transduction des cellules NK primaires. En outre, une analyse comparative entre ces réactifs à l’aide des cellules NK primaires n’a pas effectuée. Dans cette étude, on a comparé l’efficacité de la transduction des trois polymères cationiques. Les résultats montrent que, parmi ces trois polymères cationiques, seulement de dextran améliore considérablement la transduction virale efficace dans les souris et les cellules primaires humaines de NK.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude démontre que l’utilisation de dextran, un agent de polymère cationique améliore l’efficacité de la transduction des gènes des cellules NK primaires murins et humains. En outre, autres agents cationiques, comme Pb ou PS, n’ont aucun effet perceptible sur la prestation des vecteurs viraux dans les cellules primaires humaines de NK. Auparavant, il a été démontré que le Pb peut augmenter transduction du gène humain de cellules T17. Ces résultats, cependant, suggèrent que…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Lucia Sammarco et Lemonade Stand de sa Lulu pour l’inspiration, de motivation et de soutien. Ce travail a été soutenu en partie par NIH R01 AI102893 et NCI R01 CA179363 (S.M.) ; NHLBI-HL087951 (S.R.) ; NIH-CA151893-K08 (M.J.R.) ; NCI 1R01CA164225 (L.W) ; l’Alex Lemonade Stand Fondation (S.M.) ; le programme MDHR du fonds MACC (S.M. ; S.R. ; MAGNIN) ; la Fondation de la famille de Nicholas (S.M.) ; la famille Gardetto (S.M.) ; les chercheurs de Hyundai de programme (M.S.T.) ; Espoir de Hyundai sur roues (S.R.) ; la caisse de la Scam (M.S.T. et S.M.) ; Institut de recherche de l’HME, MCW (S.R.) ; et le prix de Kathy Duffey Fogerty (M.J.R.).
Materials
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
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