Декстран повышает эффективность лентивирусные трансдукции мышиных и человеческие клетки первичной
Summary
Цель этого исследования заключалась в разработке технологий, которые позволяют для успешного гена трансдукции в первичной естественной убийца (НК) клетки. Декстран опосредованной лентивирусные трансдукции человека или мыши первичной NK клеток приводит к более высокую эффективность выражения гена. Этот метод гена трансдукции значительно улучшит NK клеток генетические манипуляции.
Abstract
Эффективное трансдукции специфических генов в естественных убийца (НК) клетки был серьезной проблемой. Успешное transductions имеют решающее значение для определения роли гена интереса в разработке, дифференциация и функции НК-клеток. Последние достижения, связанные с химерных антигена рецепторов (машин) в Рак иммунотерапия подчеркнет необходимость эффективным способом доставить экзогенных генов эффекторные лимфоциты. Эффективность лентивирусные опосредованной гена transductions в первичной человека или мыши НК-клетки остаются значительно низкими, который является основным сдерживающим фактором. Последние достижения, с использованием катионных полимеров, таких как Полибрен, показывают эффективность трансдукции улучшение ген в Т-клеток. Однако эти продукты не удалось улучшить эффективность трансдукции НК-клеток. Это работа показывает, что декстрана, разветвленные глюкан полисахарид, значительно повышает эффективность трансдукции человека и первичных НК-клеток мыши. Эта методология высокую воспроизводимость трансдукции предоставляет компетентным инструмент для преобразования человека первичной НК-клеток, которые можно значительно улучшить клинические гена доставки приложений и, таким образом, NK на основе ячеек Рак иммунотерапия.
Introduction
Природные убийца (НК) клетки являются основными лимфоцитарный населения врожденной иммунной системы1. НК-клетки функционируют как защитники первой линии иммунного ответа против опухоли и инфекции2,3,4. НК-клетки также играть центральную роль в развитии терпимости через секрецию цитокинов мощным и chemokines5. Благодаря мощным способности и ликвидации опухолевых клеток в настоящее время проводятся многочисленные клинические испытания для оценки доноров производные человеческих клеток NK как адоптивной иммунотерапии рака6,7. В отличие от Т-клеток биология развития НК-клеток имеет пока быть хорошо изученных8. Этот недостаток знаний является частично из-за отсутствия эффективных методов, которые обеспечивают генов интерес к мыши или первичной NK клеток человека. По этим причинам большинство НК клеток исследования были проведены в клеточных линий, а не в Главные ячейки. Таким образом необходимость надежного и эффективного протокола передавать первичной НК-клеток с генами интерес имеет решающее значение.
Общая цель этого исследования заключалась в разработке последовательного и надежный метод, по которому первичного человека или мышиных НК-клеток может преобразованы с lenti – или ретровирусы.
Были выполнены более ранних исследований, которые пытались решить эту проблему, главным образом с помощью переходных преобразования первичного НК-клеток. Это включает плазмида трансфекции9,10, вирус Эпштейна – Барр (EBV) / ретровирусной гибрид вектор11, коровью векторные12,13и Ad5/F35 химерных векторов аденовирусных14. Несмотря на скромные эффективность этих методов преходящий характер трансдукции делает их непригодными для долгосрочного использования генетически модифицированных НК-клеток. Несколько недавних исследований использовали ретровиральных векторов передавать НК-клеток, требуется проведение нескольких циклов инфекции для достижения приемлемого уровня ген выражение11,15. В отличие от ретровиральных векторов лентивирусные векторы можно использовать клетки хозяина ядерного импорта техники для перемещать вирусный комплекс предварительных интеграции в ядре. Это является основным сдерживающим фактором в репликации вируса в-деления клеток, которые включают основной НК-клеток.
Взаимодействие между различными клетк поверхности рецепторы и вирусных частиц позволяют вирусный поглощения в клетку. Первоначальные обязательства между вирусной конверт белков и их рецепторов родственных узлов может быть ограничена из-за потенциальными отрицательными зарядами, существующие между этими двумя. Многие методы трансдукции объясняется что добавление катионных полимеров, таких как Полибрен (Pb), протамина сульфат (PS) или декстрана, могут дать положительный заряд с рецепторами клеточной поверхности и тем самым увеличить привязки вирусных конверт белки. Это увеличит эффективность слияние и поглощение вирусных частиц на клетки16. Хотя сообщалось, что Pb или PS может улучшить передачу генов в клетки T17, их применение не никакого эффекта в электромеханической эффективности первичного НК-клеток. Кроме того сравнительный анализ этих реагентов с использованием первичных НК-клетки не была выполнена. В этом исследовании сравнивали электромеханической эффективности трех катионных полимеров. Результаты показывают, что среди этих трех катионных полимеров, только декстрана значительно повышает эффективные вирусный трансдукции как мышь, так и первичной NK клеток человека.
Protocol
Representative Results
Discussion
Это исследование показывает что использование декстрана как агент Катионный полимер повышает эффективность лентивирусные трансдукции мышиных и человека первичной НК-клеток. Кроме того другие катионные агентов, таких как Pb или PS, имеют не дает ощутимого эффекта на поставку вирусных в?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Lucia Саммарко и ее Лулу лимонада стенд для вдохновения, мотивации и поддержки. Эта работа частично поддержали NIH R01 AI102893 и CA179363 по с.м R01 NCI (.); NHLBI-HL087951 (С.Р.); НИЗ CA151893-K08 (M.J.R.); NCI 1R01CA164225 (L.W); Алекса Лимонад Стенд Фонд (с.м.); HRHM программа Фонда Макк (с.м.; С.Р.; M.S.T); Фонд семьи Николая (с.м.); Семья Gardetto (с.м.); Ученые Hyundai программа (САС); Надежда Hyundai на колесах (с.р.); МАКК фонд (САС и с.м.); Детская научно-исследовательский институт, MCW (с.р.); и Кэти Фогерти Даффи премии (M.J.R.).
Materials
| Dextran | Sigma-Aldrich | 90-64-91-9 | |
| polybrene (Pb) | Sigma-Aldrich | TR-1003 | |
| protamine sulfate (PS) | Sigma-Aldrich | p3369 | |
| Trypsin | Corning | 25-052-CI | |
| RPMI1640 | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | ATALANTA | S11150 | |
| Penicillin | Corning | 30-001-CI | |
| B-mercaptoethanol | SIGMA | M3148 | |
| sodium pyruvate | Corning | MT25000CI | |
| Interferon gamma (IFN-γ ) | eBioscience | 14-7311-85 | |
| Propidium lodding staining solution | BD | 51-66211E | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000015 | |
| Isoflurane | PHOENIX | NDC 57319-559-05 | |
| NK cell negative selection kit | Stem Cell | 19855 | |
| Yac-1 | ATCC | TIB-160 | |
| K562 | ATCC | CCL-243 | |
| Mice | Jakson | 664 | |
| 293T cells | ATCC | CRL-3216 | |
| T75 flasks | Cornnig | 430641U | |
| antibody-based negative selection kits | Stem Cell | 19055 | |
| 51Chromium (Cr)-release assays | perkin elmer's | NEZ030 | |
| ELISA kits | Ebioscience | 00-4201-56 | |
| Sodium Butyrate | Sigma | 5887-5G | |
| Linear polyethylenimine | polysciences | 23966-2 | |
| Ficoll | GE Life Science | 17-1440-03 | |
| HBSS | Corning | 21-022-CV |
References
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nat. Immunol. 9, 503-510 (2008).
- Zitvogel, L., Tesniere, A., Kroemer, G. Cancer despite immunosurveillance: immunoselection and immunosubversion. Nat. Rev. Immunol. 6, 715-727 (2006).
- Arina, A., et al. Cellular liaisons of natural killer lymphocytes in immunology and immunotherapy of cancer. Expert. Opin. Biol. Ther. 7, 599-615 (2007).
- Manilay, J. O., Sykes, M. Natural killer cells and their role in graft rejection. Curr. Opin. Immunol. 10, 532-538 (1998).
- Raulet, D. H., Vance, R. E. Self-tolerance of natural killer cells. Nat. Rev. Immunol. 6, 520-531 (2006).
- Chouaib, S., et al. Improving the outcome of leukemia by natural killer cell-based immunotherapeutic strategies. Front Immunol. 5, 95 (2014).
- Dulphy, N., et al. Underground Adaptation to a Hostile Environment: Acute Myeloid Leukemia vs. Natural Killer Cells. Front Immunol. 7, 94 (2016).
- Tran, J., Kung, S. K. Lentiviral vectors mediate stable and efficient gene delivery into primary murine natural killer cells. Mol. Ther. 15, 1331-1339 (2007).
- Maasho, K., Marusina, A., Reynolds, N. M., Coligan, J. E., Borrego, F. Efficient gene transfer into the human natural killer cell line, NKL, using the Amaxa nucleofection system. J. Immunol. Methods. 284, 133-140 (2004).
- Trompeter, H. I., Weinhold, S., Thiel, C., Wernet, P., Uhrberg, M. Rapid and highly efficient gene transfer into natural killer cells by nucleofection. J. Immunol. Methods. 274, 245-256 (2003).
- Becknell, B., et al. Efficient infection of human natural killer cells with an EBV/retroviral hybrid vector. J. Immunol. Methods. 296, 115-123 (2005).
- Jiang, K., et al. Syk regulation of phosphoinositide 3-kinase-dependent NK cell function. J. Immunol. 168, 3155-3164 (2002).
- Burshtyn, D. N., et al. Conserved residues amino-terminal of cytoplasmic tyrosines contribute to the SHP-1-mediated inhibitory function of killer cell Ig-like receptors. J. Immunol. 162, 897-902 (1999).
- Schroers, R., et al. Gene transfer into human T lymphocytes and natural killer cells by Ad5/F35 chimeric adenoviral vectors. Exp. Hematol. 32, 536-546 (2004).
- Imai, C., Iwamoto, S., Campana, D. Genetic modification of primary natural killer cells overcomes inhibitory signals and induces specific killing of leukemic cells. Blood. 106, 376-383 (2005).
- Denning, W., et al. Optimization of the transductional efficiency of lentiviral vectors: effect of sera and polycations. Mol. Biotechnol. 53, 308-314 (2013).
- Lamers, C. H., Willemsen, R. A., Luider, B. A., Debets, R., Bolhuis, R. L. Protocol for gene transduction and expansion of human T lymphocytes for clinical immunogene therapy of cancer. Cancer Gene Ther. 9, 613-623 (2002).
- Campeau, E., et al. A versatile viral system for expression and depletion of proteins in mammalian cells. PLoS. ONE. 4, e6529 (2009).
- Segura, M. M., Garnier, A., Durocher, Y., Ansorge, S., Kamen, A. New protocol for lentiviral vector mass production. Methods Mol. Biol. 614, 39-52 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Signaling by Fyn-ADAP via the Carma1-Bcl-10-MAP3K7 signalosome exclusively regulates inflammatory cytokine production in NK cells. Nat. Immunol. 14, 1127-1136 (2013).
- Regunathan, J., Chen, Y., Wang, D., Malarkannan, S. NKG2D receptor-mediated NK cell function is regulated by inhibitory Ly49 receptors. Blood. 105, 233-240 (2005).
- Awasthi, A., et al. Rap1b facilitates NK cell functions via IQGAP1-mediated signalosomes. J. Exp. Med. 207, 1923-1938 (2010).
- Rajasekaran, K., et al. Transforming Growth Factor-{beta}-activated Kinase 1 Regulates Natural Killer Cell-mediated Cytotoxicity and Cytokine Production. J Biol. Chem. 286, 31213-31224 (2011).
- Wolkowicz, R., Nolan, G. P., Curran, M. A. Lentiviral vectors for the delivery of DNA into mammalian cells. Methods Mol. Biol. 246, 391-411 (2004).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Hum. Gene Ther. 23, 1090-1100 (2012).
- Cornetta, K., Anderson, W. F. Protamine sulfate as an effective alternative to polybrene in retroviral-mediated gene-transfer: implications for human gene therapy. J. Virol. Methods. 23, 187-194 (1989).
- Toyoshima, K., Vogt, P. K. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 38, 414-426 (1969).
- Jensen, M., et al. The bi-specific CD3 x NCAM antibody: a model to preactivate T cells prior to tumour cell lysis. Clin. Exp. Immunol. 134, 253-263 (2003).
