Summary

El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em> In Vitro</em

Published: January 11, 2017
doi:

Summary

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Abstract

Los estudios de proteínas integrales de membrana in vitro con frecuencia se complica por la presencia de un dominio transmembrana hidrófobo. Para complicar aún más estos estudios, la reincorporación de proteínas de membrana solubilizada con detergente en los liposomas es un proceso estocástico donde topología de la proteína es imposible de aplicar. Este trabajo ofrece un método alternativo para estas técnicas desafiantes que utiliza un andamio a base de liposomas. solubilidad de la proteína se ve reforzada por la supresión del dominio transmembrana, y estos aminoácidos se sustituyen con un resto de anclaje, tal como una etiqueta de His. Esta correa de sujeción interactúa con un grupo de anclaje (Ni 2+ coordinado por ácido nitrilotriacético (NTA (Ni 2+)) para marcado con His proteínas), que hace cumplir una topología de proteína uniforme en la superficie del liposoma. Se presenta un ejemplo en el que la interacción entre la proteína relacionada con dynamin 1 (Drp1) con una proteína de membrana, la fisión mitocondrial Factor (MFP), fue investigated utilizando este método andamio liposoma. En este trabajo, hemos demostrado la capacidad de reclutar Mff eficiente Drp1 solubles a la superficie de los liposomas, que estimuló su actividad GTPasa. Por otra parte, Drp1 pudo tubulate la plantilla de lípidos decorados a Mff en presencia de lípidos específicos. Este ejemplo demuestra la eficacia de los liposomas de andamio usando ensayos estructurales y funcionales y destaca el papel de Mff en la regulación de la actividad Drp1.

Introduction

El estudio de las interacciones proteína-proteína de membrana proximal es una tarea difícil debido a la dificultad para recapitular el entorno natural de las proteínas integrales de membrana que participan 1. Esto es debido a la necesidad de solubilización de detergente y la orientación inconsistente de proteínas en proteoliposomas. Con el fin de evitar estos problemas, se ha empleado una estrategia en la que dominios solubles de proteínas integrales de membrana se expresan como proteínas de fusión His-tag, y estos fragmentos solubles están anclados a los liposomas de andamio a través de interacciones con NTA (Ni 2+) grupos de cabeza en el lípido superficie. El uso de estos andamios, las interacciones proteína-lípido proximal pueden ser investigados en un rango de composiciones de lípidos y proteínas.

Hemos aplicado con eficacia este método para investigar las interacciones proteína-proteína críticos que rigen el ensamblaje del complejo de la fisión mitocondrial y examinar las interacciones de lípidos que modulan este proceso 2. Durante la fisión mitocondrial, una proteína de la remodelación de membrana conservada, denominado proteína relacionada con dynamin 1 (Drp1) 3, es reclutado para la superficie de la externa mitocondrial membrana (OMM) en respuesta a señales celulares que regulan la homeostasis de la energía, la señalización de apoptosis, y varias otras procesos mitocondriales integrales. Este GTPasa grande, citosólica es reclutado a la superficie de la mitocondria a través de interacciones con proteínas integrales de OMM 4 8. El papel de una de tales proteínas, Fisión mitocondrial Factor (MFP), ha sido difícil de dilucidar debido a una débil interacción aparente con Drp1 in vitro. Sin embargo, los estudios genéticos han demostrado claramente que Mff es esencial para el éxito de 7,8 fisión mitocondrial. El método descrito en este manuscrito fue capaz de superar las deficiencias anteriores mediante la introducción de lípidos interacciones simultáneas que promueven interacciones Drp1-MFP. En general, este novedoso ensayo REVEAconducido interacciones fundamentales ensamblaje del complejo de fisión mitocondrial de guía y proporcionó una nueva etapa para estudios estructurales y funcionales en curso de esta máquina molecular esencial.

Hasta la fecha, el examen de las interacciones entre Drp1 y Mff se han complicado por la flexibilidad inherente de Mff 9, la heterogeneidad de Drp1 Polímeros 2,10, y la dificultad en la purificación y reconstitución de longitud completa Mff con un dominio transmembrana intactas 11. Hemos abordado estos problemas mediante el uso de liposomas NTA (Ni2 +) de andamios para reconstituir His-Mff que carece de su dominio transmembrana (MffΔTM-Su 6). Esta estrategia fue una ventaja, ya MffΔTM era extremadamente soluble cuando se sobre-expresan en E. coli, y esta proteína aislada se reconstituyó fácilmente en liposomas de andamios. Cuando atado a estas plantillas de lípidos, Mff asumió una, la orientación hacia el exterior idéntica en la superficie de la membrana.Además de estas ventajas, los lípidos mitocondriales, tales como cardiolipina, se añadieron a estabilizar Mff plegado y la asociación con la membrana 11. La cardiolipina también interactúa con el dominio variable de Drp1 2,12 que puede estabilizar esta región desordenada y facilitar el montaje de la maquinaria de fisión.

Este método robusto es ampliamente aplicable para futuros estudios que pretenden evaluar las interacciones proteína-membrana proximal. Mediante el uso de interacciones adicionales tethering / afinidad, la sofisticación de estos estudios de reconstitución de membrana se puede mejorar para imitar la complejidad adicional que se encuentra en la superficie de las membranas dentro de las células. Al mismo tiempo, las composiciones lipídicas se pueden modificar para imitar con mayor precisión los ambientes nativos de estos complejos macromoleculares. En resumen, este método proporciona un medio para examinar las contribuciones relativas de las proteínas y lípidos de membrana en la configuración de morfologías que durante proc celulares críticaseses.

Protocol

1. Preparación de liposomas Andamios NOTA: Idealmente, los experimentos iniciales se debe utilizar un andamio relativamente simple y sin rasgos (compuesto por DOPC (1,2-sn dioleoyl- glicero-3-fosfocolina o PC) y DGS-NTA (Ni2 +) (1,2-dioleoil – sn -glicero-3 – [(N – (5-amino-1-carboxipentil) iminodiacético) succinil]. (sal de níquel)) Building fuera de estos experimentos, la carga de los lípidos, la flexibilidad, y la curvatura puede introducirse como f…

Representative Results

Mientras que la interacción entre Drp1 y Mff ha demostrado ser importante para la fisión mitocondrial, esta interacción ha sido difícil de recapitular in vitro. Nuestro objetivo era emular mejor el entorno celular en el que Drp1 y Mff interactúan. Con este fin, los liposomas que contienen concentraciones limitantes de NTA (Ni 2+) grupos de cabeza se prepararon mediante rehidratación de una película de lípidos como se describió anteriormente. La solución de l…

Discussion

Este protocolo ofrece un método para la investigación de las interacciones proteína-proteína que participa en proteínas integrales de membrana. Mediante la utilización de un andamio modular de liposomas, los investigadores son capaces de evaluar la actividad de una o más proteínas en un entorno de lípidos proximal. Estudios anteriores han demostrado un método similar para las enzimas de los receptores de la membrana plasmática 24-26. Hemos ampliado este método para incorporar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

Materials

Phosphatidylcholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti Polar Lipids 850725
DGS-NTA(Ni2+) Avanti Polar Lipids 790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL) Avanti Polar Lipids 840012
Chloroform Acros Organics 268320010
Liposome Extruder Avanti Polar Lipids 610023
Cu/Rh Negative Stain Grids Ted Pella 79712
Microfuge Tube Beckman 357448
GTP Jena Biosciences NU-1012
GMP-PCP Sigma Aldrich M3509
Microtiter Plate strips Thermo Scientific 469949
EDTA Acros Organics 40993-0010
Instant Blue Coomassie Dye Expedeon ISB1L
HEPES Fisher Scientific BP310
BME Sigma Aldrich M6250
KCL Fisher Scientific P330
KOH Fisher Scientific P250
Magnesium Chloride Acros Organics 223211000
4-20% SDS-PAGE Gel Bio Rad 456-1096
4x Laemmli Loading Dye Bio Rad 161-0747
HCL Fisher Scientific A144S
Malachite Green Carbinol Sigma Aldrich 229105
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma Aldrich A7302
Laboratory Film Parafilm PM-996
Uranyl Acetate Polysciences 21447
Tecnai T12 100 keV Microscope FEI
Optima MAX Beckman
TLA-55 Rotor Beckman
Refrigerated CentriVap Concentrator Labconico
Mastercycler Pro Thermocycler Eppendorf
VersaMax Microplate reader Molecular Devices

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Cite This Article
Clinton, R. W., Mears, J. A. Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (119), e54971, doi:10.3791/54971 (2017).

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