This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.
Изучение интегральных мембранных белков в пробирке часто осложняется наличием гидрофобного трансмембранного домена. Еще более усложняют эти исследования, реинкорпорация моющих-солюбилизированного мембранных белков в липосомы является случайным процессом, где топология белка невозможно провести в жизнь. Эта статья предлагает альтернативный метод для этих сложных методов, которые использует липосом на основе строительных лесов. растворимость белков усиливается за счет делеции трансмембранного домена, и эти аминокислоты заменяются привязывать остатком, такие как His-меткой. Этот фал взаимодействует с анкерной группой (Ni 2+ координируется нитрилтриуксусная кислоты (NTA (Ni 2+)) для His-меченных белков), который вводит единую топологию белка на поверхности липосом. Приведен пример, в котором взаимодействие между динамина связанных с белком 1 (drp1) с интегральным мембранным белком, митохондриальной осколочного Factor (ММФ), был Investigated с помощью этого метода эшафот липосом. В этой работе мы продемонстрировали способность ММФ эффективно вербовать растворимого drp1 к поверхности липосом, что стимулировало его активность ГТФ. Кроме того, drp1 смог придавать трубчатую форму ММФ-украшенный шаблон липидов в присутствии специфических липидов. Этот пример демонстрирует эффективность каркасных липосом с использованием структурных и функциональных анализов и выдвигает на первый план роль ММФ в регуляции активности drp1.
Изучение мембранных проксимальных белок-белковых взаимодействий является сложной задачи из – за трудностей в обобщал родную среду интегральных мембранных белков , участвующих 1. Это связано с необходимостью моющего средства солюбилизации и непоследовательное ориентации белков в протеолипосомах. Для того , чтобы избежать этих проблем, мы использовали стратегию , в котором растворимые домены интегральных мембранных белков выражают в виде His-Tag слитых белков, и эти растворимые фрагменты прикреплены к каркасных липосом с помощью взаимодействий с NTA (Ni 2+) в полярных головных групп липидов поверхность. С помощью этих каркасах, липидные-проксимальный белковых взаимодействий могут быть исследованы в диапазоне липидного и белкового состава.
Мы эффективно применять этот метод для исследования критических белок-белковых взаимодействий, которые регулируют сборку митохондриального комплекса деления и изучения липидных взаимодействий, которые модулируют этот прocess 2. Во время митохондриального деления, законсервированный мембраны ремоделирования белок, называемый динамина-белок , связанный с 1 (drp1) 3, рекрутируется на поверхности наружной мембраны митохондрии (ОММ) в ответ на клеточные сигналы , которые регулируют энергетический гомеостаз, апоптический сигнализации, а также ряд других интегральные митохондриальные процессы. Этот большой, цитозольная GTPase рекрутируется на поверхности митохондрий через взаимодействие с интегральными белками OMM 4 – 8. Роль одного из таких белков, митохондриальная Деление фактор (ММФ), было трудно выяснить , из – за очевидного слабого взаимодействия с drp1 в пробирке. Тем не менее, генетические исследования ясно показали , что ММФ имеет важное значение для успешного митохондриальной 7,8 деления. Описанный в этой рукописи метод был в состоянии преодолеть прежние недостатки путем введения одновременных липидных взаимодействий, которые способствуют drp1-MFF взаимодействий. В целом, этот новый анализ reveaвел фундаментальные взаимодействия руководящих сборку митохондриального комплекса деления и обеспечило новый этап для текущих структурных и функциональных исследований этой важной молекулярной машины.
На сегодняшний день изучение взаимодействий между drp1 и MFF были осложнены гибкость , присущую MFF 9, разнородность drp1 полимеры 2,10, и трудность очистки и воссоздании полной длины MFF с интактным трансмембранный домен 11. Мы рассмотрели эти проблемы с помощью NTA (Ni 2+) эшафот липосом для воссоздания Его-меченый MFF не хватает его трансмембранный домен (MffΔTM-His 6). Эта стратегия была выгодна , поскольку MffΔTM был чрезвычайно растворим , когда чрезмерно выраженная в Е. палочка, и этот изолированный белок легко восстанавливали на эшафот липосом. Когда привязанными к этим шаблонам липида, МФФ предполагается идентичную, обращенной наружу ориентацию на поверхности мембраны.В дополнение к этим преимуществам, митохондриальные липиды, такие как кардиолипину, были добавлены к стабилизации МФФ складывание и ассоциации с мембраной 11. Кардиолипин также взаимодействует с вариабельным доменом drp1 2,12 , который может стабилизировать неупорядоченную область и облегчить сборку машин деления.
Этот надежный метод широко применим для будущих исследований, направленных на оценку мембранных проксимальных белковых взаимодействий. За счет использования дополнительных прикрепление / аффинных взаимодействий, изощренность этих Мембрана восстанавливающих исследований могут быть улучшены, чтобы имитировать дополнительные сложности, обнаруженные на поверхности мембран в клетках. В то же время, липидные композиции могут быть модифицированы, чтобы более точно имитировать родной среды этих макромолекулярных комплексов. Таким образом, этот метод обеспечивает средство для изучения относительного вклада белков и липидов в формировании мембранных морфологию к во время критических клеточного ргосцессы.
Этот протокол предлагает метод исследования белок-белковых взаимодействий, связанных с интегральными мембранными белками. Используя модульную липосомальной леску, исследователи способны оценить активность одного или нескольких белков в липидном проксимальных среде. Предыдущие ис?…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).
Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
KCL | Fisher Scientific | P330 | |
KOH | Fisher Scientific | P250 | |
Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
4-20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
HCL | Fisher Scientific | A144S | |
Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
Optima MAX | Beckman | ||
TLA-55 Rotor | Beckman | ||
Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |