Summary

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em> In Vitro</em

Published: January 11, 2017
doi:

Summary

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Abstract

Studien von integralen Membranproteinen in vitro sind durch die Anwesenheit einer hydrophoben Transmembrandomäne häufig kompliziert. Weitere diese Studien zu verkomplizieren, reincorporation von Waschmittel-solubilisierte Membranproteine ​​in Liposomen ist ein stochastischer Prozess, in dem Protein-Topologie zur Durchsetzung unmöglich ist. Dieses Papier bietet eine alternative Methode, um diese anspruchsvollen Techniken, die ein Liposom-basierten Gerüst verwendet. Protein Löslichkeit wird durch die Deletion der Transmembrandomäne erhöht und diese Aminosäuren sind mit einem Anbinden Einheit ersetzt, wie beispielsweise ein His-Tag. Dieser Haltegurt wirkt mit einer Ankergruppe (Ni 2+ koordiniert von Nitrilotriessigsäure (NTA (Ni 2+)) für His-markierte Proteine), die an der Oberfläche des Liposoms eine einheitliche Protein – Topologie erzwingt. Ein Beispiel präsentiert wird, wobei die Wechselwirkung zwischen Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) mit einem integralen Membranprotein, Mitochondrial Fission Factor (MFF) wurde investigated dieses Gerüst Liposom-Verfahren. In dieser Arbeit haben wir die Fähigkeit von Mff demonstriert effizient löslich DRP1 an die Oberfläche von Liposomen zu rekrutieren, die ihre GTPase-Aktivität stimuliert. Darüber hinaus war DRP1 der Lage, die MFF-dekorierten Lipid-Vorlage in Gegenwart von spezifischen Lipiden tubulate. Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit der Gerüst Liposomen strukturellen und funktionellen Assays und unterstreicht die Rolle von Mff Aktivitäts DRP1 regulieren.

Introduction

Studium membran proximal Protein-Protein – Wechselwirkungen ist eine herausfordernde Fangen wegen der Schwierigkeit in der natürlichen Umgebung der integralen Membranproteine beteiligt rekapituliert 1. Dies ist aufgrund der Notwendigkeit des Waschmittels Solubilisierung und der inkonsistenten Orientierung von Proteinen in Proteoliposomen. Um diese Probleme zu vermeiden, haben wir eine Strategie eingesetzt , wobei lösliche Membrandomänen integraler Membranproteine exprimiert werden als His-Tag – Fusionsproteine, und diese löslichen Fragmente werden auf Gerüst Liposomen über Wechselwirkungen mit NTA (Ni 2+) Kopfgruppen am Lipid verankert Oberfläche. Unter Verwendung dieser Gerüste, lipid-proximale Protein-Wechselwirkungen können über einen Bereich von Lipid- und Proteinzusammensetzungen untersucht werden.

Wir haben effektiv diese Methode angewandt, um die kritische Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, die Montage der mitochondrialen Spaltung komplexer regieren und Lipid-Wechselwirkungen zu untersuchen, die diese pr modulierenocess 2. Während mitochondrialen Spaltung, eine konservierte Membran – Remodeling – Protein, Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) 3 genannt, wird auf die Oberfläche der äußeren Mitochondrienmembran (OMM) in Reaktion auf zelluläre Signale eingestellt , die Energie – Homöostase, apoptotische Signal regulieren, und mehrere andere Integral mitochondrialen Prozesse. 8 Dieses große wird zytosolische GTPase an die Oberfläche der Mitochondrien durch Wechselwirkungen mit Proteinen integral OMM 4 eingestellt. Die Rolle eines solchen Proteins, Mitochondrial Fission Factor (MFF), ist schwierig gewesen , aufgrund einer scheinbaren schwache Wechselwirkung mit DRP1 in vitro zu untersuchen. Dennoch haben genetische Studien eindeutig gezeigt , dass Mff für eine erfolgreiche mitochondrialen Spaltung 7,8 wesentlich ist. Das Verfahren in diesem Manuskript beschrieben konnte früheren Mängel zu überwinden, indem die gleichzeitige Lipid-Wechselwirkungen, die Einführung von DRP1-Mff Wechselwirkungen fördern. Insgesamt ist dieses neuen Assay REVEAführte fundamentalen Wechselwirkungen der Montage der mitochondrialen Spaltung komplexer Führung und eine neue Etappe für die laufende strukturelle und funktionelle Untersuchungen dieser wesentlichen molekularen Maschine zur Verfügung gestellt.

Bislang Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen DRP1 und Mff haben durch die inhärente Flexibilität der Mff 9, die Heterogenität der DRP1 Polymeren 2,10, und die Schwierigkeit bei der Reinigung und Rekonstitution von voller Länge Mff mit einer intakten Transmembran- Domäne 11 kompliziert. Wir adressiert diese Herausforderungen mithilfe von NTA (Ni 2+) Gerüst Liposomen His-markierte Mff fehlt seine Transmembran – Domäne (MffΔTM-His 6) zu rekonstruieren. Diese Strategie war vorteilhaft , da MffΔTM extrem gut löslich war , als überexprimiert in E. coli, und das isolierte Protein wurde auf Gerüst Liposomen leicht wiederhergestellt. Wenn auf diese Lipid templates gebunden, angenommen Mff eine identische, nach außen weisende Orientierung an der Oberfläche der Membran.Zusätzlich zu diesen Vorteilen wurden mitochondrialen Lipiden, wie Cardiolipin, hinzugefügt Mff Faltung und Assoziation mit der Membran 11 zu stabilisieren. Cardiolipin interagiert auch mit der variablen Domäne der DRP1 2,12 welche diese ungeordneten Bereich stabilisieren kann und die Montage der Spaltmaschinen erleichtern.

Diese robuste Methode ist allgemein anwendbar für zukünftige Studien, die Membran-proximalen Protein-Wechselwirkungen zu bewerten suchen. Durch den Einsatz von zusätzlichen Anbinden / affine Wechselwirkungen kann die Komplexität dieser Membran Rekonstitution Untersuchungen verbessert werden zusätzliche Komplexität an der Oberfläche der Membranen in Zellen zu imitieren. Zur gleichen Zeit, Lipidzusammensetzungen können modifiziert werden, um mehr, um genau die nativen Umgebungen dieser makromolekularen Komplexen nachahmen. Zusammenfassend stellt dieses Verfahren ein Mittel, um die relativen Beiträge von Proteinen und Lipiden in der Gestaltung Membranmorphologien bei kritischen zellulären proc zu untersuchenzesse.

Protocol

1. Scaffold Liposome Vorbereitung HINWEIS: eine relativ einfache und featureless Gerüst (bestehend aus DOPC (1,2-Dioleoyl – sn – glycero-3-phosphocholin oder PC) und DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-Dioleoyl, anfänglichen Experimenten sollte Idealer verwenden – sn – glycero-3 – [(N – (5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure) succinyl]. (Nickelsalz)) , das weg von diesen Experimenten Lipidladung, Flexibilität und Krümmung kann als einzelne Faktoren eingeführt …

Representative Results

Während die Interaktion zwischen DRP1 und Mff nachgewiesen wurde für mitochondriale Spaltung wichtig zu sein, hat diese Interaktion schwierig gewesen , in vitro zu rekapitulieren. Unser Ziel war es besser, die zelluläre Umgebung emulieren, wobei DRP1 und Mff interagieren. Zu diesem Zweck Liposomen , die Grenzkonzentrationen von NTA (Ni 2+) Kopfgruppen wurden durch Rehydratisieren ein Lipidfilm hergestellt , wie oben beschrieben. Die Lipidlösung besteht zunächst a…

Discussion

Dieses Protokoll bietet ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen integralen Membranproteinen. Durch ein modulares Gerüst Liposom verwendet wird, sind Forscher, die die Aktivität eines oder mehrerer Proteine ​​in einer Lipid-Umgebung proximal zu beurteilen. 26 Frühere Studien haben eine ähnliche Methode für die Rezeptorenzyme der Plasmamembran 24 gezeigt. Wir haben dieses Verfahren erweitert, um Lipid-Cofaktoren integrieren und zu erforschen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

Materials

Phosphatidylcholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti Polar Lipids 850725
DGS-NTA(Ni2+) Avanti Polar Lipids 790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL) Avanti Polar Lipids 840012
Chloroform Acros Organics 268320010
Liposome Extruder Avanti Polar Lipids 610023
Cu/Rh Negative Stain Grids Ted Pella 79712
Microfuge Tube Beckman 357448
GTP Jena Biosciences NU-1012
GMP-PCP Sigma Aldrich M3509
Microtiter Plate strips Thermo Scientific 469949
EDTA Acros Organics 40993-0010
Instant Blue Coomassie Dye Expedeon ISB1L
HEPES Fisher Scientific BP310
BME Sigma Aldrich M6250
KCL Fisher Scientific P330
KOH Fisher Scientific P250
Magnesium Chloride Acros Organics 223211000
4-20% SDS-PAGE Gel Bio Rad 456-1096
4x Laemmli Loading Dye Bio Rad 161-0747
HCL Fisher Scientific A144S
Malachite Green Carbinol Sigma Aldrich 229105
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma Aldrich A7302
Laboratory Film Parafilm PM-996
Uranyl Acetate Polysciences 21447
Tecnai T12 100 keV Microscope FEI
Optima MAX Beckman
TLA-55 Rotor Beckman
Refrigerated CentriVap Concentrator Labconico
Mastercycler Pro Thermocycler Eppendorf
VersaMax Microplate reader Molecular Devices

References

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Clinton, R. W., Mears, J. A. Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (119), e54971, doi:10.3791/54971 (2017).

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