Summary

Generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos de sangre entera

Published: December 24, 2016
doi:

Summary

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Abstract

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.

The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Introduction

Las células dendríticas (DC) son las más importantes células presentadoras de antígeno especializadas de nuestro sistema inmune. Inmaduros países en desarrollo (IDC) residen en la piel o en los tejidos de las mucosas y son, por tanto, una de las primeras células inmunes para interactuar con los patógenos invasores. DCs representan el puente entre el innato y el sistema inmune adaptativo 1, ya que pueden activar células T y B respuestas después de la detección de patógenos. Además, contribuyen a la respuesta inmune pro-inflamatorias, debido a la secreción de grandes cantidades de citoquinas, tales como IL-1β, IL-6, y IL-12. DCs también activar las células NK y atraer otras células inmunes en el sitio de la infección por quimiotaxis.

DCs se puede dividir en células inmaduras dendríticas (IDC) y células dendríticas maduras (PMD) 2 en función de su morfología y función. Tras el reconocimiento de antígenos extraños por uno de los muchos receptores de reconocimiento de patrones (por ejemplo, los receptores tipo toll, de tipo Clectinas, o receptores del complemento) abundantemente expresado en la superficie celular, SIRD sufren cambios importantes y empiezan a madurar. Durante este proceso de maduración, los receptores de captura de antígeno están regulados hacia abajo, mientras que las moléculas esenciales para la presentación de antígenos son regulados hasta 3. DC maduras hasta de regular los principales complejos de histocompatibilidad I y II (MHC I y II), las moléculas co-estimuladoras como CD80 y CD86, que son esenciales para la presentación del antígeno y la activación de los linfocitos T. Además, se induce la expresión de receptores de quimioquinas CCR7 en la superficie celular, que permite la migración de los DC de los tejidos periféricos a los ganglios linfáticos. La migración se facilita por el "balanceo" de las DC a lo largo de un ligando de quimiocina 19 (CCL19 / MIP-3b) y el gradiente de ligando de quimiocina 21 (CCL21 / SLC) a los ganglios linfáticos 4-6.

Después de la migración, mDCs presentan el antígeno procesado a Naïve células CD4 + y CD8 +, por lo tanto ininego- una respuesta inmunitaria adaptativa contra el patógeno invasor 7. Esta interacción con las células T en los ganglios linfáticos también se asocia con la propagación del virus 8. Otros estudios in vitro revelaron que DCs captura y transferencia del VIH a las células T y que este resultado de la transmisión en una infección vigorosa 9-12 eficiente. Estos experimentos ponen de manifiesto que en vivo explota a los países en desarrollo VIH como un servicio de transporte desde la periferia hacia los ganglios linfáticos. Durante la presentación del antígeno, las DC secretan interleuquinas clave que dan forma a la diferenciación de las células efectoras T helper, y por lo tanto, el resultado de toda la respuesta inmune contra el microbio se determina en este mismo interacción. Además de tipo 1 (Th1) y de tipo 2 (Th2) T efectoras, otros subconjuntos de células T CD4 + helper (por ejemplo, tipo 17 (Th17) y tipo 22 (células Th22) T) se han descrito, y su inducción y la función se han investigado a fondo. DCs están implicados además enla generación de células T reguladoras (Tregs) 13,14. Estas células son inmunosupresores y pueden detener o regular a la baja la inducción o la proliferación de las células T efectoras y son por tanto cruciales para el desarrollo de la inmunidad y la tolerancia.

DC convencionales Humanos (CDC) comprenden varios subconjuntos de células con un origen mieloide (es decir, células de Langerhans (CL) y dérmica y las CD intersticiales) o un origen linfoide (es decir, países en desarrollo plasmocitoide (PDC)). Para los experimentos in vitro o estrategias de vacunación DC, DCs derivadas de monocitos se utilizan habitualmente como modelo para DCs dérmicos. Estas células muestran similitudes en la fisiología, la morfología y la función a las células dendríticas mieloides convencionales. Se generan por la adición de interleucina 4 (IL-4) y de granulocitos y macrófagos, factor estimulante de colonias (GM-CSF) a monocitos aislados de donantes sanos 12,15-18. Las células dendríticas también pueden ser directamente aisladas de biopsias dérmicas o de las mucosas, o puede incluso be desarrolló a partir de células progenitoras hematopoyéticas aisladas de muestras de sangre de cordón umbilical obtenidas fuera del útero CD34 +. Aquí, demostramos cómo se aíslan y se estimularon a partir de sangre humana anti-coagulada después de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de enriquecimiento por centrifugación en gradiente de densidad de monocitos. Después de la incubación durante 5 días, los monocitos humanos bajo condiciones específicas se diferencian en SIRD y están listos para los procedimientos experimentales en un entorno no clínico.

Protocol

Ética declaración: Escrito se obtuvo el consentimiento de todos los donantes de sangre que participaron por el Instituto Central de Transfusión de Sangre y Departamento inmunológica, Innsbruck, Austria. El uso de las muestras sobrantes anónimos para fines científicos fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad de Medicina de Innsbruck. 1. enriquecimiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) La concentración de las PBMC por centrifugación. <li…

Representative Results

Después de la centrifugación de la sangre anticoagulada usando un colchón de sacarosa, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se enriquecen en una interfase en la parte superior del medio de gradiente de densidad (Figura 1). Después de que los PBMCs se extraen, el análisis FACS se realiza para caracterizar las diferentes poblaciones de células dentro de los PBMCs utilizando marcadores de linaje (por ejemplo, CD3 para los linfocitos T, CD1…

Discussion

Este protocolo describe la generación de células dendríticas derivadas de monocitos (MDDCs) a través del aislamiento de los monocitos humanos de sangre anticoagulada utilizando un ensayo basado en nanopartícula magnética. En este protocolo, las etapas de centrifugación se llevan a cabo aguas arriba del procedimiento de aislamiento de células, lo que conduce a un enriquecimiento de la fracción de PBMC. Aunque las células se pierden durante la centrifugación, para superponer el contenido de una bolsa de sangre …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).

Materials

APC Mouse Anti-Human CD19  Clone  HIB19 BD Biosciences 555415
APC Mouse Anti-Human CD83  Clone  HB15e BD Biosciences 551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles  BD Biosciences 557769
BD Imagnet BD Biosciences 552311
BSA (Albumin Fraction V) Carl Roth EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Costar 3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Bio-Sciences 17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Sigma-Aldrich D8537
Falcon 10mL Serological Pipet Corning 357551
Falcon 25mL Serological Pipet Corning 357525
Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes Corning 352054
FITC Mouse Anti-Human CD3  Clone  HIT3a BD Biosciences 555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) Tonbo biosciences 13-0870
GM-CSF MACS Miltenyi Biotec 130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) Gibco 10500-064
Hettich Rotanta 460R Hettich
IL-4 CC PromoKine C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X)  BD Biosciences 552362
L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin VWR 211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14  Clone  M5E2 BD Biosciences 555398
PE Mouse Anti-Human CD209  Clone  DCN46 BD Biosciences 551265
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R0883
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020

References

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Cite This Article
Posch, W., Lass-Flörl, C., Wilflingseder, D. Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood. J. Vis. Exp. (118), e54968, doi:10.3791/54968 (2016).

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