Genereren van Human-monocyten afgeleide dendritische cellen uit volbloed
Summary
Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.
Abstract
Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity.
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to naïve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.
Introduction
Dendritische cellen (DCs) zijn de belangrijkste gespecialiseerde antigen presenterende cellen van het immuunsysteem. Onrijpe DC (IDC's) bevinden zich in de huid of in de mucosale weefsels en behoren daarom tot de eerste immuuncellen om te interageren met het binnenvallen van ziekteverwekkers. DCs vertegenwoordigen de brug tussen het aangeboren en adaptieve immuunsysteem 1, omdat ze T- en B-cel responsen na detectie van pathogenen kunnen activeren. Voorts dragen zij bij aan pro-inflammatoire immuunrespons door de afscheiding van grote hoeveelheden cytokines, zoals IL-1β, IL-6 en IL-12. DCs ook activeren NK cellen en andere immuuncellen naar de plaats van infectie door chemotaxis trekken.
DC's kunnen worden onderverdeeld in onrijpe dendritische cellen (IDC's) en gerijpte dendritische cellen (mDC) 2 op basis van hun morfologie en functie. Na de erkenning van buitenlandse antigenen door een van de vele receptoren patroonherkenning (bijv toll-like receptoren, C-typelectinen, receptoren of complement) overvloedig tot expressie gebracht op het celoppervlak, IDC ondergaan grote veranderingen en beginnen te rijpen. Tijdens dit rijpingsproces, receptoren voor antigeen-capture worden down-gereguleerd, terwijl moleculen die essentieel zijn voor antigeen presentatie zijn up-gereguleerd 3. Mature DCs up-reguleren van de major histocompatibility complex I en II (MHC I en II), co-stimulerende moleculen zoals CD80 en CD86, die essentieel zijn voor antigeen presentatie en activatie van T-lymfocyten. Bovendien wordt de uitdrukking van chemokine receptor CCR7 op het celoppervlak veroorzaakt, die de migratie van DCs van perifere weefsels naar de lymfeklieren maakt. De migratie wordt vergemakkelijkt door het "rollen" van DCs langs een chemokine ligand 19 (CCL19 / MIP-3b) en chemokine ligand 21 (CCL21 / SLC) gradiënt naar de lymfeklieren 4-6.
Na migratie mDC presenteren verwerkt antigeen CD4 + en CD8 + T-cellen naïeve, waardoor initiating een adaptieve immuunrespons tegen het binnendringende pathogeen 7. Deze interactie met T-cellen in de lymfeknopen wordt ook geassocieerd met de verspreiding van het virus 8. Andere in vitro studies toonden aan dat DCs efficiënt te vangen en over te dragen aan HIV T-cellen en dat deze overdracht resulteert in een krachtige infectie 9-12. Deze experimenten wijzen erop dat in vivo HIV exploits DCs als shuttles van de periferie naar de lymfeklieren. Tijdens antigeenpresentatie, DC scheiden sleutel interleukinen dat de differentiatie van effector T-helpercellen vorm, en daarom wordt het resultaat van de volledige immuunrespons tegen de microbe bepaald op dit interactie. Naast het type 1 (Th1) en type 2 (Th2) effector T-cellen, andere subgroepen van CD4 + T helpercellen (bijv type 17 (Th17) en type 22 (Th22) T-cellen) zijn beschreven, en hun introductie en functie zijn grondig onderzocht. DCs zijn verder betrokken bijde generatie van regulatoire T-cellen (Tregs) 13,14. Deze cellen zijn immunosuppressieve en kan stoppen of omlaag reguleren inductie of proliferatie van effector T-cellen en zijn dus cruciaal voor de ontwikkeling van de immuniteit en tolerantie.
Human conventionele DC (CDC) bestaan uit verschillende subsets van cellen met een myeloïde oorsprong (dat wil zeggen, Langerhans cellen (LC) en via de huid en interstitiële DC) of een lymfoïde oorsprong (dat wil zeggen, plasmacytoide DCs (pDCs)). Voor in vitro experimenten of DC vaccinatie strategieën, zijn monocyt afgeleid DCs routinematig gebruikt als een model voor dermal DCs. Deze cellen vertonen overeenkomsten in fysiologie, morfologie en functie gebruikelijke myeloïde dendritische cellen. Zij worden gegenereerd door toevoeging van interleukine 4 (IL-4) en granulocyt-macrofaag-koloniestimulerende factor (GM-CSF) aan monocyten geïsoleerd uit gezonde donoren 12,15-18. Dendritische cellen kunnen ook direct worden geïsoleerd uit de huid of slijmvlies biopten, of kan zelfs be ontwikkeld uit CD34 + hematopoietische stamcellen geïsoleerd uit navelstrengbloed monsters verkregen ex baarmoeder. Hier laten we zien hoe monocyten zijn geïsoleerd en gestimuleerd uit anti-gecoaguleerd menselijk bloed na perifere mononucleaire cel (PBMC) verrijking door dichtheidsgradiënt centrifugeren. Na incubatie gedurende 5 dagen, humane monocyten onder specifieke condities gedifferentieerd in IDC's en zijn klaar voor experimentele procedures in een niet-klinische omgeving.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschrijft de vorming van monocyten afgeleide dendritische cellen (MDDCs) door de isolatie van humane monocyten uit anti-gecoaguleerd volbloed met behulp van een magnetische nanodeeltjes gebaseerde test. In dit protocol worden de centrifugatiestappen uitgevoerd vóór de cel isolatiewerkwijze, hetgeen leidt tot een verrijking van de PBMC fractie. Hoewel cellen verloren tijdens het centrifugeren, de inhoud van een pakket op volbloed dichtheidsgradiënt medium overlay zou vereisen 200-300 ml van de dichtheids…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank our technician Karolin Thurnes, Divison of Hygiene and Medical Microbiology, and Dr. Annelies Mühlbacher and Dr. Paul Hörtnagl, Central Institute for Blood Transfusion and Immunological Department, for their valuable help and support regarding this manuscript. We thank the Austrian Science Fund for supporting this work (P24598 to DW, P25389 to WP).
Materials
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10mL Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25mL Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50mL High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | — | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10X) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1,5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
- Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
- Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
- Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
- McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
- Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
- Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
- Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
- Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
- Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, 1368-1374 (2012).
- Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
- Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
- Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
