Unicellulare espressione genica Utilizzando Multiplex RT-qPCR per caratterizzare eterogeneità delle rare popolazioni linfoidi

Nel corso degli ultimi anni, le cellule linfoidi innate (ILCS) sono stati sempre più studiati. Nonostante la loro mancanza di recettori antigene-specifiche, essi appartengono al lignaggio linfoidi e rappresentano sentinelle importanti per l'omeostasi dei tessuti e l'infiammazione. ILCs sono attualmente divisi in tre gruppi in base alla loro espressione di specifiche combinazioni di fattori di trascrizione e sulla loro capacità di produrre citochine ^{6, 7.}

ILC contribuiscono a numerose situazioni omeostatici e fisiopatologici in diversi organi attraverso la produzione di citochine specifiche ^{8, 9.} Per essere in grado di comprendere il ruolo di queste cellule, è importante determinare le varie sottopopolazioni ILC per organo e per identificare le loro relazioni evolutive. Inoltre, fenomeni di plasticità tra i diversi sottoinsiemi sono stati correlati. Studiando l'eterogeneitàdelle cellule presenti in un organo, è possibile delimitare la loro fase di maturazione e distinguere le loro funzioni specifiche.

Per illustrare la tecnica di multiplex cella singola RT-qPCR, ILC epatici sono stati scelti, con una particolare attenzione per la loro eterogeneità all'interno dello stesso gruppo ILC (tipo 1 ILC) ^10. Innanzitutto, attraverso l'uso di citometria a flusso, tre popolazioni ILC distinti stati caratterizzati nel fegato. Gruppo 1 ILC rappresenta circa il 80% degli effettori innati, mentre le altre due popolazioni sono rari popolazioni ILC epatiche (meno del 5% degli effettori innati). Quelle popolazioni sono stati ordinati utilizzando marcatori superficie cellulare ampiamente espresse delle popolazioni ILC. Come risultato, scelti popolazioni ILC nel fegato guardano uno sostanzialmente simile ad un altro.

Multiplex cella singola RT-qPCR è emerso come uno dei migliori tecniche per investigare prontamente l'eterogeneità di queste popolazioni ¹¹ </sup>. Due caratteristiche principali sono determinate dalla sfruttando il multiplex cella singola tecnica di RT-qPCR. Innanzitutto, cercando a livello clonale, è possibile recuperare l'espressione genica specifica delle cellule per il confronto tra le cellule che apparentemente mostrano stadi di sviluppo simili. Poi, cercando in una combinazione pre-selezionata di espressione genica, si determinerà nuove firme genetiche sulla base di modelli di espressione genica simultanee a un certo punto del tempo. Questi aspetti permettono la raccolta di una grande varietà di dati di espressione per un gran numero di cellule, anche in rare popolazioni, dato che la tecnica viene eseguita a livello clonale. In tal modo, l'eterogeneità ILC nel fegato può essere adeguatamente valutata.

Avanti, di classificare tutte le cellule con un fenotipo ILC globale, un'ampia panoramica della espressione genica multiple del fegato popolazioni ILC si ottiene, anche se rappresentano popolazioni estremamente rari. Un chip microfluidica-based consente la sperimentazione con ancorauna piccola quantità di materiale cellulare. Di conseguenza, i profili di espressione genica di popolazioni di cellule rare possono essere ottenuti. Usando in linea gene firma software di analisi, i cluster di popolazione cellulare e potenziali relazioni di cellule può essere indagato. Di conseguenza, i test funzionali possono essere eseguiti per convalidare i dati di clustering al livello in vivo.

Decine di espressione genica può essere stabilita contemporaneamente su centinaia o più celle singole sullo stesso chip ^{3, 11, 12.} Progettazione del saggio è la parte più lunga e più importante di questo esperimento. La determinazione dei geni rilevanti per l'ipotesi da testare è fondamentale per ottenere risultati rilevanti. In secondo luogo, sono necessari dei controlli interni (come marcatori di superficie noti utilizzati per l'ordinamento) e controlli specifici. Ciò è fondamentale per testare la specificità di primer di amplificazione, l'efficienza dell'amplificazione, e tegli assenza di concorrenza primer. Pertanto, lavorando con multiplex cella singola RT-qPCR è una tecnica risparmiare tempo, come espressione multipla gene di una cella è valutata allo stesso tempo.

Utilizzando lo stesso chip e miscelazione dei reagenti per tutte le celle limita i possibili errori di manipolazione e consente riproducibilità tra i campioni. Complessivamente, i diversi aspetti della multiplex singola cellula RT-qPCR consente la produzione di risultati altamente affidabili a livello clonale, con un grande livello di sensibilità per un'ampia varietà di campioni e geni. I risultati ottenuti offrono dati potenti e affidabili per i test di biostatistica.

Ciò può essere ottenuto grazie all'aspetto microfluidica del metodo, che consente di lavorare su piccolissime quantità di materiale e porta a risultati esaustivi. Infine, utilizzando software online, è possibile confrontare le popolazioni desiderati.