ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים

במהלך השנים האחרונות, תאי הלימפה מולד (ILCs) נחקרו יותר ויותר. למרות חוסר קולטנים אנטיגן ספציפי, הם שייכים שושלת הלימפה ולייצג זקיפים חשובים הומאוסטזיס לרקמות ודלקת. ILCs כיום מחולקים לשלוש קבוצות על בסיס הביטוי שלהם שילובים גורם שעתוק ספציפיים על יכולתם לייצר ציטוקינים ^{6, 7.}

ILCs מובילים למצבים ההומיאוסטטית ו pathophysiological רבים באיברים מגוונים באמצעות ציטוקינים ספציפיים ייצור ^{8, 9.} כדי להיות מסוגל להבין את התפקיד של תאים אלה, חשוב לקבוע את תת-אוכלוסיות ILC השונות לכל איבר ולזהות קשרי ההתפתחות שלהם. בנוסף, תופעות של פלסטיות בין תת השונים נקשרו. על ידי לימוד הטרוגניותשל תאים הנמצאים איבר אחד, אפשר לתחום הבמה של התבגרות שלהם להבחין הפונקציות הספציפיות שלהם.

כדי להמחיש את הטכניקה של תא בודד זמנית RT-qPCR, ILCs הכבד נבחר, עם דגש מיוחד על ההטרוגניות שלהם בתוך אותה קבוצת ILC (סוג 1 ILC) ^10. ראשית, באמצעות שימוש cytometry זרימה, שלוש אוכלוסיות ILC ברורים התאפיינו בכבד. הקבוצה 1 ILC מייצג כ 80% של effectors הטבעי תוך שתי האוכלוסיות האחרות הן אוכלוסיות ILC כבדות נדירות (פחות מ -5% של effectors המולדת). אלה אוכלוסיות מוינו באמצעות סמנים על פני קרום התא ביטוי נרחב של אוכלוסיות ILC. כתוצאה מכך, מסודר אוכלוסיות ILC בכבד להסתכל אחד דומה במידה רבה אחר.

זמנית מתא בודד RT-qPCR התפתחה אחת הטכניקות הטובות ביותר כדי לחקור את ההטרוגניות ללא דיחוי על אוכלוסיות אלה ¹¹ </sעד>. שני מאפיינים עיקריים נקבעים על ידי ניצול של טכניקת תא הבודד זמנית RT-qPCR. ראשית, על ידי הסתכלות על רמת המשובטים, אפשר לשחזר ביטוי גנים תא ספציפי להשוואה בין תאים שכנראה להציג שלבי ההתפתחות דומה. לאחר מכן, ע"י הסתכלות שילוב שנבחר מראש של ביטוי גנים, נוכל לקבוע חתימות גן חדשות המבוססת על דפוסי ביטוי גנים בו זמנית בנקודת זמן אחת. היבטים אלה מאפשרים גביית מגוון רחב של נתונים הביטוי עבור מספר גדול של תאים, אפילו על אוכלוסיות נדירות, מאז הטכניקה מבוצעת ברמה המשובטת. ובכך, ההטרוגניות ILC בכבד ניתן להעריך כראוי.

לאחר מכן, על ידי מיון כל התאים עם פנוטיפ עולמי ILC, סקירה רחבה של הביטוי המרובה הגן של האוכלוסיות הכבדות ILC מתקבלת, למרות שהם מייצגים אוכלוסיות נדירות ביותר. שבב מבוסס microfluidic מאפשר התנסות אפילוכמות קטנה של חומר תא. כתוצאה מכך, פרופילי ביטוי גנים של אוכלוסיות תאים נדירות ניתן להשיג. באמצעות תוכנת ניתוח חתימת הגן באינטרנט, אשכולות אוכלוסיית תאים ומערכות יחסים תא פוטנציאליים יכולים להיחקר. כתוצאה מכך, ניתן לבצע בדיקות פונקציונליות כדי לאמת את נתוני אשכולות ברמת vivo.

עשרות ביטויי גנים ניתן להעריך בו זמנית על מאה או תאים בודדים יותר על אותו השבב ^{3, 11, 12.} עיצוב של assay הוא החלק הארוך ביותר והחשוב ביותר של הניסוי. הקביעה של הגנים הרלוונטיים להשערה להיבדק היא בעל חשיבות עליונה כדי לקבל תוצאות רלוונטיות. שנית, בקרה פנימית (כגון משטח סמנים ידועים הנמצאים בשימוש למיון) ובקרות ספציפיות נדרשות. זה חיוני כדי לבדוק את הספציפיות הגברת פריימר, את היעילות של ההגברה, ו- Tהוא היעדר תחרות פריימר. לכן, עבודה עם רב מפלסי תא בודד RT-qPCR היא טכניקה חיסכון בזמן, כביטוי-גן המרובה של תא נבחן בעת ​​ובעונה האחת.

שימוש באותו שבב ותמהיל ריאגנטים עבור כל התאים מגביל את השגיאות האפשריות של מניפולציה ומאפשר שחזור בין דגימות. בסך הכל, את ההיבטים השונים של תא בודד זמנית RT-qPCR מאפשרים לייצור תוצאות האמינות ביותר ברמה המשובטת, עם רמה גדולה של רגישות למגוון רחב של דוגמאות וגנים. התוצאות שהתקבלו להציע נתונים חזקים ויציבים לבדיקות biostatistical.

זו יכולה להיות מושגת בשל היבט microfluidic של השיטה, המאפשרת עבודה על כמויות קטנות מאוד של חומר ומובילה לתוצאות ממצות. לבסוף, בעזרת תוכנה באופן מקוון, אפשר להשוות את האוכלוסיות הרצויות.