Eencellige genexpressie met behulp van Multiplex RT-qPCR heterogeniteit van Rare lymfoïde populaties karakteriseren

In de afgelopen jaren, aangeboren lymfoïde cellen (ILC) in toenemende mate onderzocht. Ondanks het ontbreken van antigeen-specifieke receptoren, zij behoren tot de lymfoïde afstamming en vormen belangrijke wachters voor weefsel homeostase en ontsteking. ILC's worden momenteel onderverdeeld in drie groepen op basis van hun expressie van specifieke transcriptiefactor en combinaties van hun vermogen om cytokinen ^{6, 7} produceren.

ILC tot talrijke homeostatische en pathofysiologische situaties in diverse organen via specifieke cytokineproductie ^{8, 9.} Om de rol van deze cellen te begrijpen, is het belangrijk om de verschillende subpopulaties ILC per orgaan bepalen en hun ontwikkeling relaties aan te geven. Bovendien zijn verschijnselen plasticiteit tussen de verschillende subgroepen gerelateerd. Door het bestuderen van de heterogeniteitvan de onderhavige in een orgaan cellen, is het mogelijk om het stadium van rijping te bepalen en hun specifieke functies te onderscheiden.

Om de techniek van single-cell multiplex RT-qPCR te illustreren, werden de lever ILC gekozen, met een bijzondere nadruk op de heterogeniteit binnen dezelfde ILC groep (type 1 ILC) ^10. Enerzijds door middel van flowcytometrie, werden drie verschillende populaties ILC kenmerk in de lever. Groep 1 ILC vertegenwoordigt ongeveer 80% van het aangeboren effectoren, terwijl de twee andere populaties zeldzame hepatische ILC populatie (minder dan 5% van het aangeboren effectoren). Die populaties werden gesorteerd met behulp van algemeen voor het celoppervlak markers van ILC populaties. Hierdoor gesorteerd ILC populaties in de lever kijken grote lijnen gelijk aan elkaar.

Eencellige multiplex RT-qPCR heeft ontpopt als een van de beste technieken om onmiddellijk een onderzoek in de heterogeniteit van deze populaties ¹¹ </sup>. Twee belangrijke eigenschappen worden bepaald door gebruik te maken van de eencellige multiplex RT-qPCR techniek. Ten eerste, door naar de klonale niveau, is het mogelijk om cel-specifieke genexpressie herstellen gedurende vergelijking van cellen die blijkbaar vergelijkbaar ontwikkelingsstadia geven. Vervolgens, door naar een vooraf geselecteerde combinatie van genexpressie, zullen we nieuwe genen handtekeningen bepalen gebaseerd op de gelijktijdige genexpressie patronen op één tijdstip. Deze aspecten staat hem toe allerlei expressie gegevens voor een groot aantal cellen, zelfs op zeldzame populatie, omdat de techniek wordt uitgevoerd op klonale niveau. Daardoor kan ILC heterogeniteit in de lever voldoende beoordeeld.

Vervolgens sorteert alle cellen met een globaal ILC fenotype, een breed overzicht van de meervoudige genexpressie van de lever ILC populaties wordt verkregen, hoewel ze vertegenwoordigen uiterst zeldzaam populaties. A-microfluïdische gebaseerde chip maakt het mogelijk experimenteren met nogeen kleine hoeveelheid celmateriaal. Bijgevolg kan de genexpressieprofielen van zeldzame celpopulaties worden verkregen. Met behulp van online gen handtekening analyse software, mobiele bevolking clusters en potentiële cel relaties kunnen worden onderzocht. Bijgevolg kunnen functionele tests worden uitgevoerd om de clustering gegevens op in vivo niveau valideren.

Tientallen genexpressies kunnen gelijktijdig worden beoordeeld op honderden of meerdere elementaire cellen op dezelfde chip ^{3, 11, 12.} Uitvoering van de test is het langste en belangrijkste deel van het experiment. De bepaling van de genen voor de hypothese relevant beproeven essentieel om relevante resultaten te verkrijgen. Ten tweede, interne controle (zoals bekend oppervlaktemerkers gebruikt voor sorteren) en specifieke controles nodig. Dit is belangrijk om de primer amplificatie specificiteit, de efficiëntie van de amplificatie en t testenHij afwezigheid van primer concurrentie. Daarom werken met eencellige multiplex RT-qPCR is een tijdbesparende techniek als meervoudige genexpressie van een cel wordt beoordeeld tegelijkertijd.

Met dezelfde chip en mengeling van reagentia voor alle cellen beperkt de mogelijke fouten van manipulatie en maakt reproduceerbaarheid tussen monsters. Geheel, de verschillende aspecten van eencellige multiplex RT-qPCR maakt de productie van zeer betrouwbare resultaten op klonale niveau met een grote mate van gevoeligheid voor diverse monsters en genen. De behaalde resultaten bieden krachtige en betrouwbare gegevens voor biostatistical testen.

Dit kan worden bereikt door de microfluïdische aspect van de methode, waarmee het werk aan zeer kleine hoeveelheden materiaal en leidt tot uitgebreide gegevens. Bovendien zullen, met online software, is het mogelijk om de gewenste populaties vergelijken.