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Genetics

Conjugadas acasalamento Os ensaios para a análise específica da sequência de proteínas de transferência envolvidos na conjugação bacteriana

Published: January 04, 2017
doi:
10.3791/54854
, , , , ,
1Department of Chemistry,York University, 2The Centre for Research on Biomolecular Interactions,York University

Summary

Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.

Abstract

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.

Introduction

A transferência de genes e proteínas ao nível micro-organismo ao desempenha um papel central na sobrevivência e evolução bacteriana, bem como processos de infecção. A troca do ADN entre as bactérias ou entre uma bactéria e uma célula pode ser conseguido através de transformação, conjugação ou transdução de vector. Conjugação 1,2 é único em comparação com a transformação e transdução em que durante a conjugação entre as bactérias gram-negativas tais como Escherichia coli, a transferência de ADN ocorre de um modo controlado-doador no qual um sistema macromolecular complexa liga células dadoras e receptoras. A conjugação é também a maneira mais direta em que as células bacterianas interagem com as células hospedeiras para injetar genes, proteínas ou produtos químicos para sistemas host. 3 Muitas vezes, a transferência desses agentes tem efeitos notáveis sobre o anfitrião, que vão desde patogenia e carcinogênese para hospedar evolução e adaptação. Tem sido demonstrado que recombinatio conjugativon aumenta a taxa de adaptação 3 vezes em bactérias com taxas de mutação elevadas sob condições de stress ambiental. 4 Além disso, a conjugação é de longe a via mais comum, através do qual os genes de resistência a antibióticos em estirpes bacterianas são distribuídos. 5,6

Os microrganismos têm evoluído sistemas de secreção especializados para suportar a transferência de macromoléculas através das membranas celulares; existem actualmente 9 tipos de sistemas de secreção (TSSs) em bactérias gram-negativas que foram descritos: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, bem como a SEC (secreção) e Tat (de dois arginina translocação) vias. 7,8 Cada tipo de sistema de secreção é dividido em diferentes subtipos, uma necessidade devido à diversidade de proteínas e o carácter distintivo de caminhos envolvidos, em diferentes estirpes bacterianas. Por exemplo, no sistema de secreção de tipo IV (T4SS), os sistemas de Ti e facilitar o transporte CAG efector ao passo que a F-plasmídeo, R27 umnd pKM101 T4SSs facilitar a transferência de um plasmídeo conjugada. 7,9,10 uma compreensão detalhada dos mecanismos pelos quais os organismos montam os seus respectivos sistemas de secreção de proteínas a partir de seus componentes e partilham conteúdo celular com um receptor ou o seu ambiente circundante é um factor importante no desenvolvimento de estratégias que apontam para combater microrganismos patogénicos e processos de infecção celular.

Após a conjugação bacteriana identificação inicial em E. coli por Lederberg & Tatum, 11 de um grande número de plasmídeos conjugativos móveis e têm sido identificadas e caracterizadas. 12 Tais plasmídeos móveis mostrar considerável gama é de tamanho (de 1 a mais de 200 quilobases (kb)), no entanto, todos os plasmídeos móveis contêm um relaxase, que reconhece a origem de transferência (oriT) permitindo assim a transmissão do plasmídeo. Os plasmídeos conjuntivos mais genes codificam para a montagem de um T4SS funcional, bem como um tipoproteína de ligação IV. 12 Por exemplo, a 100 kb F plasmídeo de E. coli codifica todos os genes conjugadas dentro de uma transferência de 33,3 kB (tra) região. 13 Os genes na região do tra do plasmídeo codifica F todas as proteínas que facilitam a formação de pilus, Acasalamento formação de pares (MPF), a transferência de DNA e as funções de exclusão durante a transferência de plasmídeo conjugada. 10,14,15 Um corpo significativo de conhecimento está disponível para T4SSs conjugada, porém detalhado estudos estruturais das proteínas conjugadas e complexos só são mais recentemente se tornando disponíveis. 16-28

Para montar uma visão abrangente do processo conjugada, é necessário um acoplamento de estudos estruturais detalhados para mutacional análises de proteínas de transferência conjugadas. Isto pode ser conseguido através de ensaios de encaixe conjugadas. Para o plasmídeo F, cada proteína codificada dentro da região de TRA desempenha um papel na co-F mediadanjugation; por conseguinte, o nocaute / eliminação de um gene de transferência vai abolir a capacidade conjugadas das células (Figura 1). Enquanto plasmídeos celulares mais pequenas são mais conducentes para procedimentos de eliminação padrão, por plasmídeos conjugativos maiores, tais como F, nocaute de genes são mais prontamente conseguidas através de recombinação homóloga em que o gene alvo é substituída com uma transmissão de um gene de resistência a antibiótico distinta. No protocolo atual, que empregam recombinação homóloga para substituir um gene transfer de interesse com cloranfenicol acetiltransferase (CAT) na 55 kb F plasmídeo derivado pOX38-Tc; 29,30 nocaute o plasmídeo resultante, pOX38-Tc :: Δgene Cm, facilita a resistência à presença de cloranfenicol (Cm) no meio de crescimento. células dadoras que albergam pOX38-Tc :: Δgene cm são incapazes de afectar conjugativo transferência de ADN / acasalamento como observado através da utilização de um ensaio de acoplamento; a eficácia de acoplamento de uma célula doadora pOX38-Tc Δgene :: cm e uma recip normaistário vai diminuir ou, mais frequentemente, ser abolido. transferência conjugativa do plasmídeo pOX38-Tc :: Δgene cm pode ser restaurada por meio de uma pequena recuperação de plasmídeo que alberga o gene alvo de transferência. Este plasmídeo de recuperação pode ser uma que proporciona a expressão constitutiva, tal como pK184 plasmídeo (pK184-gene), 31 ou um que fornece expressão indutível enquanto que o plasmídeo alvo correctamente o gene para a localização correcta no interior da célula (citoplasma ou periplasma). Consequentemente, em ensaios de acasalamento entre este novo doador (abrigando pOX38-Tc Δgene plasmídeos :: Cm + pK184 de gene) e uma célula receptora, a eficiência de acoplamento é esperado para restaurar a quase que de um ensaio de acoplamento doador-receptor normal. Este sistema permite uma para sondar a função do gene eliminado por meio da geração de uma série de construções pK184-Gene (deleções ou mutações pontuais) e testando a capacidade de cada construção para restaurar a capacidade de acoplamento do pOX38-Tc Δgene :: Cm abrigando célula doadoras.

Protocol

1. Produção de construções de ADN Designing Oligómeros para recombinação homóloga do gene alvo Design um único oligómero de 55-72 pb para a frente como se segue: (a) escolher uma sequência de nucleótidos de comprimento 19-32 pb que é homóloga a uma sequência de ADN na região de 10-100 pb a montante do local de início da extremidade 5 'do gene da cloranfenicol-acetiltransferase no plasmídeo pBAD33 comercial, 32 e (b) seleccionar um nucleótido 36-54 pb…

Representative Results

O processo de conjugação bacteriana F-driven plasmídeo é um processo coordenado que envolve proteínas de transferência dentro da região do tra de o F-plasmídeo que monta um T4SS para facilitar a síntese de pilus e transferência de ADN conjugativo. A proteína TRAF (Registo de GenBank # BAA97961; UniProt ID P14497) é necessária para a formação de F-pilus conjugativo. 10,14,35 – 37 A proteína contém um domínio tioredoxina-como C-te…

Discussion

processo de conjugação bacteriana fornece um meio pelo qual as bactérias podem espalhar genes proporcionando uma vantagem evolutiva para o crescimento em ambientes difíceis, tais como a propagação de marcadores de resistência a antibióticos. Porque muitos dos plasmídeos conjugativos são tão grandes, 12 estudos funcionais sobre as proteínas envolvidas na montagem do aparelho de transferência através de mutação de genes alvo no próprio plasmídeo conjugativo são pesadas. Os protocolos aqui des…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada por uma Grant Descoberta da Ciência e Engenharia Conselho Natural do Canadá (NSERC).

Materials

GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit Fisher Scientific K0503
GeneJet Gel Extraction Kit Fisher Scientific K0692
GeneJet PCR Purification Kit Fisher Scientific K0702
Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit New England Biolabs E0554S
Broad Range DNA Ladder New England Biolabs N0303A
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875713
Electroporator Eppendorf 4309000027
Electroporation cuvettes Fisher Scientific FB101 Cuvettes have a 1 mm gap.
Enzymes
AvaI New England Biolabs R0152S
EcoRI New England Biolabs R0101S
HindIII New England Biolabs R0104L
NdeI New England Biolabs R0111S
Phusion DNA Polymerase New England Biolabs M0530L
T4 DNA Ligase New England Biolabs M0202S
DpnI New England Biolabs R0176S
Antibiotics Final Concentrations
Chloramphenicol (Cm) Fisher Scientific BP904-100 20 µg/mL
Kanamycin (Km) BioBasic Inc. DB0286 50 µg/mL
Nalidixic acid (Nal) Sigma-Aldrich N8878-25G 10 µg/mL
Rifampicin (Rif) Calbiochem 557303 20 µg/mL
Tetracycline (Tc) Fisher Scientific BP912-100 10 µg/mL
Streptomycin (Sm) Fisher Scientific BP910-50 50 µg/mL
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References

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Conjugative Mating AssaysTransfer ProteinsBacterial ConjugationType Four Secretion ComplexHomologous RecombinationPBAD33 PlasmidCat CassettePCR AmplificationElectrocompetent DY330R CellsPOX38-Tc Plasmid

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Erdogan, F., Lento, C., Yaseen, A., Nowroozi-Dayeni, R., Kheyson, S., Audette, G. F. Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (119), e54854, doi:10.3791/54854 (2017).
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