Конъюгативных Спаривание Анализы для последовательности конкретного анализа переноса белков, участвующих в конъюгации бактерий

Перенос генов и белков на микро-организменном уровне играет центральную роль в выживаемости бактерий и эволюции, а также инфекционных процессов. Обмен ДНК между бактериями или между бактерией и клеткой может быть достигнуто с помощью трансформации, конъюгации или вектором трансдукции. ^1,2 Сопряжение уникальна по сравнению с трансформацией и трансдукции в том , что при конъюгации между грамотрицательных бактерий , таких как кишечная палочка, перенос ДНК происходит в донорной-контролируемым способом , посредством которого комплекс макромолекулярная система соединяет донора и реципиента клетки. Сопряжение также самый прямой путь, в котором бактериальные клетки взаимодействуют с клетками-хозяевами, чтобы ввести гены, белки или химические вещества, чтобы хост-системах. ³ Довольно часто, передача таких агентов имеет замечательные эффекты на хозяина, начиная от патогенеза и канцерогенеза провести эволюцию и адаптацию. Было показано, что конъюгативная recombinatioп увеличивает скорость адаптации в 3 раза у бактерий с высоким уровнем мутаций в условиях экологического стресса. ⁴ Кроме того, конъюгация на сегодняшний день является наиболее распространенным путем , через который гены устойчивости к антибиотикам в бактериальных штаммов рассредоточены. ^5,6

Микроорганизмы развивались специализированные системы секреции для поддержки передачи макромолекул через клеточные мембраны; Есть в настоящее время 9 типов систем секреции (ЦСС) в грамотрицательных бактерий, которые были описаны: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, а также Sec (секреции) и Tat (два-Аргинин транслокации) пути. ^7,8 Каждый тип системы секреции дополнительно делится на различные подтипы, необходимость из – за разнообразия белков и своеобразия путей , участвующих в различных бактериальных штаммов. Например, в системе секреции IV типа (T4SS), системы Ti и CAG облегчают эффекторной транспорт в то время как F-плазмиды, Р27й pKM101 T4SSs облегчают передачу конъюгативной плазмиды. ^7,9,10 Детальное понимание механизмов , с помощью которых организмы собирают свои системы секреции из их составных белков и разделяют клеточное содержимое с получателем или их окружающей среды является важным фактором в развитии целевых стратегий борьбы с патогенными микроорганизмами и процессы клеточная инфекция.

После первоначальной идентификации конъюгации бактерий в E.coli путем Ледербергом & Tatum, ¹¹ большое количество мобильных и конъюгативных плазмид были идентифицированы и охарактеризованы. ¹² Такие мобильные плазмид показывают значительный диапазон размеров (от 1 до более чем 200 т.п.н. (КБ)), однако все мобильные плазмиды содержат relaxase, признающей происхождение передачи (ОРИТ) , тем самым позволяя передачу плазмиды. Конъюгативных плазмид дополнительные гены кодируют для сборки функционального T4SS, а также типIV соединительный белок. ¹² Например, 100 кб F плазмиды E.coli , кодирует все конъюгативных гены в пределах 33,3 кБ передачи (TRA) области. ¹³ Гены ТНС области плазмиды закодировать F все белки , которые способствуют образованию фимбриевый, присоединительными образования пар (MPF), перенос ДНК и функции исключения во время конъюгативного переноса плазмиды. ^10,14,15 Значительный объем знаний доступен для конъюгативной T4SSs, однако подробно Структурные исследования конъюгативных белков и комплексов только в последнее время становятся доступными. ^{16 – 28}

Для того, чтобы собрать полное представление о конъюгативной процесса, соединительное детальных структурных исследований для мутационный анализ конъюгативных белков переноса требуется. Это может быть достигнуто с помощью конъюгативных сопрягаемых анализов. Для получения плазмиды F, каждый белок , кодируемый в пределах области тра играет определенную роль в F-опосредованного соnjugation; поэтому, нокаута / удаление гена переноса отменит конъюгативных способность клетки (рисунок 1). В то время как более мелкие мобильные Плазмиды являются более благоприятными для стандартных процедур, удаление, для больших конъюгативных плазмид, таких как F, нокаут гена более легко достигается с помощью гомологичной рекомбинации, где ген-мишень заменен одним передать отчетливое ген устойчивости к антибиотику. В текущем протоколе, мы используем гомологичной рекомбинации, чтобы заменить ген переноса интереса с хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) в 55 кб F плазмиды производное pOX38-Tc; ^29,30 результирующая Нокаут плазмиду pOX38-Tc Δgene :: Cm, способствует устойчивости к наличию хлорамфеникола (Cm) в ростовой среде. Донорские клетки, несущие pOX38-Tc Δgene :: Cm не могут влиять на конъюгативного переноса ДНК / спаривание, как наблюдаемое за счет использования пробирного сопрягаемой; эффективность спаривание донора клетки pOX38-Tc Δgene :: Cm и нормальный Recipнике, будет уменьшаться или, чаще, быть отменена. Конъюгативных перенос плазмиды pOX38-Tc Δgene :: Cm может быть восстановлен с помощью небольшой плазмиды восстановления укрывает целевого гена переноса. Это восстановление плазмида может быть тот , который обеспечивает конститутивную экспрессию, такой как плазмида pK184 (pK184-гена), ³¹ или тот , который обеспечивает индуцируемой экспрессии до тех пор , как плазмида правильно ориентирована ген на правильное расположение внутри клетки (цитоплазме или периплазмы). Следовательно, в брачных анализах между этим новым донором (укрывательство pOX38-Tc Δgene :: Cm + pK184-гена плазмид) и клетку-реципиент, эффективность спаривание, как ожидается, восстановление до почти у нормального донора и реципиента сопрягаемой анализа. Эта система дает возможность исследовать функцию выбиты гена через поколение серии pK184-генных конструкций (делеции или точечные мутации) и тестирование способности каждой конструкции, чтобы восстановить брачный потенциал укрывательство pOX38-Tc Δgene :: Cm донор клетокs.