Coniugazione saggi di accoppiamento per l'analisi specifica per sequenza di proteine di trasferimento relativi coniugazione batterica
Summary
Here, we present a protocol to knockout a gene of interest involved in plasmid conjugation and subsequently analyze the impact of its absence using mating assays. The function of the gene is further explored to a specific region of its sequence using deletion or point mutations.
Abstract
The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia coli, these transfer proteins make up a DNA transfer machinery known as the mating pair formation, or DNA transfer complex, which facilitates conjugative plasmid transfer. The objective of this paper is to provide a method that can be used to determine the role of a specific transfer protein that is involved in conjugation using a series of deletions and/or point mutations in combination with mating assays. The target gene is knocked out on the conjugative plasmid and is then provided in trans through the use of a small recovery plasmid harboring the target gene. Mutations affecting the target gene on the recovery plasmid can reveal information about functional aspects of the target protein that result in the alteration of mating efficiency of donor cells harboring the mutated gene. Alterations in mating efficiency provide insight into the role and importance of the particular transfer protein, or a region therein, in facilitating conjugative DNA transfer. Coupling this mating assay with detailed three-dimensional structural studies will provide a comprehensive understanding of the function of the conjugative transfer protein as well as provide a means for identifying and characterizing regions of protein-protein interaction.
Introduction
Il trasferimento di geni e proteine a livello micro-organismal svolge un ruolo centrale nella sopravvivenza dei batteri e l'evoluzione, nonché i processi di infezione. Lo scambio di DNA tra batteri o tra un batterio e una cellula può essere ottenuto attraverso la trasformazione, coniugazione o trasduzione vettoriale. 1,2 coniugazione è unico rispetto alla trasformazione e trasduzione dal fatto che durante la coniugazione tra batteri gram-negativi come Escherichia coli, il trasferimento del DNA avviene in modo donatore controllato quale un sistema macromolecolare complesso collega cellule donatrici e riceventi. Coniugazione è anche il modo più diretto in cui le cellule batteriche interagiscono con le cellule ospiti per iniettare i geni, proteine o sostanze chimiche a sistemi host. 3 Molto spesso, il trasferimento di tali agenti ha effetti notevoli sulla serie, che vanno dalla patogenesi e carcinogenesi ad ospitare evoluzione e adattamento. E 'stato dimostrato che recombinatio conjugativen aumenta il tasso di adattamento 3 volte nei batteri con alti tassi di mutazione in condizioni di stress ambientale. 4 Inoltre, la coniugazione è di gran lunga la via più comune attraverso il quale si diffondono i geni di resistenza agli antibiotici in ceppi batterici. 5,6
I microrganismi sono evoluti sistemi di secrezione specializzati per supportare il trasferimento di macromolecole attraverso le membrane cellulari; attualmente ci sono 9 tipi di sistemi di secrezione (Tsss) in batteri gram negativi che sono stati descritti: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, così come la Sec (secrezione) e Tat (due-arginina traslocazione) percorsi. 7,8 Ogni tipo di sistema di secrezione è ulteriormente suddiviso in diversi sottotipi, una necessità a causa della diversità delle proteine e la peculiarità di meccanismi coinvolti, in differenti ceppi batterici. Ad esempio, nel sistema di secrezione di tipo IV (T4SS), i sistemi di Ti e Cag facilitano il trasporto effettore che l'F-plasmide, R27 unND pKM101 T4SSs facilitare il trasferimento di un plasmide coniugativo. 7,9,10 Una comprensione dettagliata dei meccanismi attraverso i quali gli organismi assemblano i loro rispettivi sistemi di secrezione dalle loro proteine componenti e condividono contenuti cellulari con un destinatario o il loro ambiente circostante è un fattore importante per lo sviluppo di strategie mirate per combattere i microrganismi e processi di patogeni infezione cellulare.
Dopo l'identificazione coniugazione batterica iniziale in E. coli da Lederberg e Tatum, 11 sono state identificate e caratterizzate numerose plasmidi mobili e coniugazione. 12 Tali plasmidi mobili mostrano notevole gamma è formato (da 1 a oltre 200 kilobasi (kb)), tuttavia tutti i plasmidi mobili contengono una relaxase, che riconosce l'origine di trasferimento (orit) consentendo così la trasmissione del plasmide. plasmidi coniugativi ulteriori geni codificano per il montaggio di un T4SS funzionale così come un tipoIV proteine accoppiamento. 12 Ad esempio 100 kb F plasmide di E. coli codifica tutti i geni coniugazione di una regione (tra) 33,3 trasferimento kB. 13 I geni della regione Tra del plasmide codifica F tutte le proteine che facilitano la formazione di pilus, accoppiamento formazione coppia (MPF), il trasferimento del DNA e le funzioni di esclusione durante il trasferimento plasmide conjugative. 10,14,15 un corpus significativo di conoscenze è disponibile per conjugative T4SSs, per quanto dettagliati studi strutturali delle proteine e dei complessi di coniugazione sono solo più di recente diventando disponibili. 16 – 28
Per assemblare una visione complessiva del processo conjugative, è necessario un accoppiamento di studi strutturali dettagliate per mutazionale analisi delle proteine di trasferimento coniugazione. Ciò può essere ottenuto mediante saggi accoppiamento coniugazione. Per il plasmide F, ciascuna proteina codificata all'interno della regione di tra gioca un ruolo nella co F-mediatanjugation; Pertanto, il knockout / delezione di un gene transfer abolisce la capacità conjugative della cella (Figura 1). Mentre più piccoli plasmidi mobili sono più favorevoli per le procedure di cancellazione standard per i plasmidi coniugazione più grandi come F, knockout genici si ottengono più facilmente tramite ricombinazione omologa in cui il gene bersaglio viene sostituito con uno trasmettere un distinto gene di resistenza agli antibiotici. Nel protocollo corrente, ci avvaliamo di ricombinazione omologa per sostituire un gene trasferimento di interesse con cloramfenicolo acetiltransferasi (CAT) nella 55 kb F plasmide derivato pOX38-Tc; 29,30 plasmide knockout risultante, pOX38-Tc Δgene :: Cm, facilita resistenza alla presenza di cloramfenicolo (Cm) in terreni di crescita. Cellule del donatore ospitano pOX38-Tc Δgene :: Cm potuto influenzare conjugative trasferimento di DNA / accoppiamento come osservata attraverso l'uso di un saggio di accoppiamento; l'efficienza di accoppiamento di una cellula donatrice pOX38-Tc Δgene :: cm e una recip normaleiente diminuirà o, più spesso, essere abolito. trasferimento conjugative del plasmide pOX38-Tc Δgene :: Cm può essere ripristinato tramite un piccolo plasmide recupero ospitare il gene trasferimento mirato. Questo plasmide recupero può essere uno che fornisce l'espressione costitutiva, come plasmide pK184 (pK184-gene), 31 o uno che fornisce l'espressione inducibile finché tale plasmide obiettivi correttamente il gene nella posizione corretta all'interno della cellula (citoplasma o periplasma). Di conseguenza, in saggi di accoppiamento tra questo nuovo donatore (ospitare pOX38-Tc Δgene plasmidi :: Cm + pK184-gene) ed una cellula ricevente, l'efficienza di accoppiamento è previsto per ripristinare quasi quella di un normale dosaggio accoppiamento donatore-ricevente. Questo sistema permette di sondare la funzione del gene eliminato attraverso la generazione di una serie di costrutti pK184 gene (delezioni o mutazioni puntiformi) e testare la capacità di ogni costrutto di ripristinare la capacità di accoppiamento del harbouring pOX38-Tc Δgene :: Cm cellula donatriceS.
Protocol
Representative Results
Discussion
processo Coniugazione batterica fornisce un mezzo attraverso il quale i batteri possono diffondersi geni mediante un vantaggio evolutivo di crescita in ambienti difficili, come la diffusione di marcatori di resistenza agli antibiotici. Poiché molti dei plasmidi coniugativi sono così grandi, 12 studi funzionali sulle proteine coinvolte nel montaggio del dispositivo di trasferimento attraverso la mutazione di geni bersaglio sul plasmide coniugativo si sono ingombranti. I protocolli descritti qui forniscono un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione da parte del Discovery Sciences & Engineering Consiglio Naturale del Canada (NSERC).
Materials
| GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit | Fisher Scientific | K0503 | |
| GeneJet Gel Extraction Kit | Fisher Scientific | K0692 | |
| GeneJet PCR Purification Kit | Fisher Scientific | K0702 | |
| Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit | New England Biolabs | E0554S | |
| Broad Range DNA Ladder | New England Biolabs | N0303A | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| Electroporator | Eppendorf | 4309000027 | |
| Electroporation cuvettes | Fisher Scientific | FB101 | Cuvettes have a 1 mm gap. |
| Enzymes | |||
| AvaI | New England Biolabs | R0152S | |
| EcoRI | New England Biolabs | R0101S | |
| HindIII | New England Biolabs | R0104L | |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | |
| Phusion DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530L | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| DpnI | New England Biolabs | R0176S | |
| Antibiotics | Final Concentrations | ||
| Chloramphenicol (Cm) | Fisher Scientific | BP904-100 | 20 µg/mL |
| Kanamycin (Km) | BioBasic Inc. | DB0286 | 50 µg/mL |
| Nalidixic acid (Nal) | Sigma-Aldrich | N8878-25G | 10 µg/mL |
| Rifampicin (Rif) | Calbiochem | 557303 | 20 µg/mL |
| Tetracycline (Tc) | Fisher Scientific | BP912-100 | 10 µg/mL |
| Streptomycin (Sm) | Fisher Scientific | BP910-50 | 50 µg/mL |
References
- Dobrindt, U., Hochhut, B., Hentschel, U., Hacker, J. Genomic islands in pathogenic and environmental microorganisms. Nat Rev Microbiol. 2 (5), 414-424 (2004).
- Furuya, E. Y., Lowy, F. D. Antimicrobial-resistant bacteria in the community setting. Nat Rev Microbiol. 4 (1), 36-45 (2006).
- Griffiths, A., Miller, J., Suzuki, D., Lewontin, R., Gelbart, W. . An Introduction to Genetic Analysis, 7th Edition. , (2000).
- Cooper, T. F., Barton, N. H. Recombination Speeds Adaptation by Reducing Competition between Beneficial Mutations in Populations of Escherichia coli. PLoS Biol. 5 (9), 225 (2007).
- Lujan, S. A., Guogas, L. M., Ragonese, H., Matson, S. W., Redinbo, M. R. Disrupting antibiotic resistance propagation by inhibiting the conjugative DNA relaxase. Proc Natl Acad Sci. 104 (30), 12282-12287 (2007).
- Carattoli, A. Plasmids and the spread of resistance. Int J Med Microbiol. 303 (6-7), 298-304 (2013).
- Shala, A., Ferraro, M., Audette, G. F., Bawa, R., Audette, G. F., Rubenstein, I. Bacterial Secretion Systems: Nanomachines for Infection and Genetic Diversity. Handbook of Clinical Nanomedicine: Nanoparticles, Imaging, Therapy and Clinical Applications. , 657-686 (2016).
- Tseng, T. T., Tyler, B. M., Setubal, J. C. Protein secretion systems in bacterial-host associations, and their description in the Gene Ontology. BMC Microbiol. 9 (1), 2 (2009).
- Alvarez-Martinez, C. E., Christie, P. J. Biological diversity of prokaryotic type IV secretion systems. Microbiol Mol Biol Rev. 73 (4), 775-808 (2009).
- Lawley, T. D., Klimke, W. A., Gubbins, M. J., Frost, L. S. F factor conjugation is a true type IV secretion system. FEMS Microbiol Lett. 224 (1), 1-15 (2003).
- Lederberg, J., Tatum, E. L. Gene Recombination in Escherichia Coli. Nature. 158 (4016), 558-558 (1946).
- Smillie, C., Garcillan-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P. C., de la Cruz, F. Mobility of Plasmids. Microbiol Mol Biol Rev. 74 (3), 434-452 (2010).
- Willetts, N., Skurray, R. The Conjugation System of F-Like Plasmids. Annu Rev Genet. 14 (1), 41-76 (1980).
- Frost, L. S., Ippen-Ihler, K., Skurray, R. A. Analysis of the sequence and gene products of the transfer region of the F sex factor. Microbiol Rev. 58 (2), 162-210 (1994).
- Audette, G. F., Manchak, J., Beatty, P., Klimke, W. A., Frost, L. S. Entry exclusion in F-like plasmids requires intact TraG in the donor that recognizes its cognate TraS in the recipient. Microbiology. 153, 442-451 (2007).
- Christie, P. J., Atmakuri, K., Krishnamoorthy, V., Jakubowski, S., Cascales, E. Biogenesis, Architecture, and Function of Bacterial Type Iv Secretion Systems. Annu Rev Microbiol. 59 (1), 451-485 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: the Agrobacterium VirB/D4 and related conjugation systems. Biochim Biophys Acta – Mol Cell Res. 1694 (1-3), 219-234 (2004).
- Bhatty, M., Laverde Gomez, J. a., Christie, P. J. The expanding bacterial type IV secretion lexicon. Res Microbiol. 164 (6), 620-639 (2013).
- Christie, P. J., Cascales, E. Structural and dynamic properties of bacterial Type IV secretion systems (Review). Mol Membr Biol. 22 (1-2), 51-61 (2005).
- Christie, P. J. Type IV secretion: Intercellular transfer of macromolecules by systems ancestrally related to conjugation machines. Mol Microbiol. 40 (2), 294-305 (2001).
- Christie, P. J., Whitaker, N., González-Rivera, C. Mechanism and structure of the bacterial type IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1843 (8), 1578-1591 (2014).
- Cascales, E. The type VI secretion toolkit. EMBO Rep. 9, 735 (2008).
- Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and Regulation of the Type VI Secretion System. Annu Rev Microbiol. 66 (1), 453-472 (2012).
- Chandran, V., et al. Structure of the outer membrane complex of a type IV secretion system. Nature. 462 (7276), 1011-1015 (2009).
- Rivera-Calzada, A., et al. Structure of a bacterial type IV secretion core complex at subnanometre resolution. EMBO J. 32 (8), 1195-1204 (2013).
- Waksman, G., Fronzes, R. Molecular architecture of bacterial type IV secretion systems. Trends Biochem Sci. 35, 691 (2010).
- Fronzes, R., Christie, P. J., Waksman, G. The structural biology of type IV secretion systems. Nat Rev Microbiol. 7 (10), 703-714 (2009).
- Kaplan, M., et al. Probing a cell-embedded megadalton protein complex by DNP-supported solid-state NMR. Nat Methods. 12 (7), 5-9 (2015).
- Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 45, 135-140 (1981).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Jobling, M. G., Holmes, R. K. Construction of vectors with the pl5a replicon, kanamycin resistance, inducible lacZα and pUC18 or pUC19 multiple cloning sites. Nucleic Acids Res. 18 (17), 5315 (1990).
- Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J., Beckwith, J. Tight regulation, modulation, and high-level expression by vectors containing the arabinose P(BAD) promoter. J Bacteriol. 177 (14), 4121-4130 (1995).
- Yu, D., et al. An efficient recombination system for chromosome engineering in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5978-5983 (2009).
- Lawley, T. D., Gilmour, M. W., Gunton, J. E., Standeven, L. J., Taylor, D. E. Functional and Mutational Analysis of Conjugative Transfer Region 1 (Tra1) from the IncHI1 Plasmid R27. J Bacteriol. 184 (8), 2173-2180 (2002).
- Elton, T. C., Holland, S. J., Frost, L. S., Hazes, B. F-Like Type IV Secretion Systems Encode Proteins with Thioredoxin Folds That Are Putative DsbC Homologues. J Bacteriol. 187 (24), 8267-8277 (2005).
- Hazes, B., Frost, L. Towards a systems biology approach to study type II/IV secretion systems. Biochim Biophys Acta. 1778, 1839-1850 (2008).
- Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F., Tsolis, R. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590 (3), 376-386 (2016).
- Audette, G. F., Van Schaik, E. J., Hazes, B., Irvin, R. T. DNA-binding protein nanotubes: Learning from nature’s nanotech examples. Nano Lett. 4, 1897-1902 (2004).
- Harris, R. L., Silverman, P. A. Tra proteins characteristic of F-like type IV secretion systems constitute an interaction group by yeast two-hybrid analysis. J Bacteriol. 186 (16), 5480-5485 (2004).
- Moore, D., et al. Characterization of the F-Plasmid Conjugative Transfer Gene traU. J Bacteriol. 172 (8), 4263-4270 (1990).
- Anthony, K. G., Sherburne, C., Sherburne, R., Frost, L. S. The role of the pilus in recipient cell recognition during bacterial conjugation mediated by F-like plasmids. Mol Microbiol. 13 (6), 939-953 (1994).
- Klimke, W. A., Frost, L. S. Genetic analysis of the role of the transfer gene, traN, of the F and R100-1 plasmids in mating pair stabilization during conjugation. J Bacteriol. 180 (16), 4036-4043 (1998).
- Jiang, W., Marraffini, L. A. CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems. Annu Rev Microbiol. 69 (1), 209-228 (2015).
- Dahlberg, C., Bergstrom, M., Andreasen, M., Christensen, B. B., Molin, S., Hermansson, M. Interspecies bacterial conjugation by plasmids from marine environments visualized by gfp expression. Mol Biol Evol. 15 (4), 385-390 (1998).
