Cefoperazone שטופל עכבר דגם של קליני רלוונטי<em> Clostridium difficile</em> R20291 הזנים
Summary
פרוטוקול זה מתאר את מודל עכבר cefoperazone של זיהום difficile Clostridium (CDI) באמצעות זן קליני רלוונטי וגנטי-צייתן, R20291. דגש על ניטור מחלה קליני, פקידת חיידקי C. difficile, cytotoxicity רעלן, ושינויי histopathological ברחבי CDI במודל של עכברים מפורטים בפרוטוקול.
Abstract
Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.
Introduction
Clostridium difficile הינו אנאירובי, חיובי-גרם, חיידק יוצרי נבגים שגורמת מסכני חיים שלשולים 1. C. difficile זיהום (CDI) קשור לתחלואה אנושית מוגדלת ותמותה ותוצאות בלמעלה מ -4.8 מיליארדים $ בעלויות בריאות בשנה 1-4. בשנת 2013, המרכז לבקרת מחלות ומניעתן מסווג difficile ג כסיכון עמידות לאנטיביוטיקה דחוף, המציין כי זה מהווה איום דחוף בריאות הציבור 1. נכון לעכשיו, טיפול אנטיביוטי עם vancomycin ו metronidazole נחשבים רמת הטיפול CDI 5. למרבה הצער, ישנות CDI לאחר טיפול מוצלח באנטיביוטיקה הן גבוהות, המתרחשות 20 – 30% מהחולים 2,5-7. לכן, הגילוי רפוי רומן נגד הפתוגן מעיים זה הכרחי. כדי להעריך רפויים נגד C. difficile, במודל חית מתקרבות מחל אדם aclinically רלוונטי זן הוא זקוק.
בתחילה, העיקרים של קוך הוקמו difficile ג בשנת 1977 תוך שימוש במודל אוגר סורי שטופלו קלינדמיצין 8. מודל זה עדיין משמש כיום כדי לחקור את ההשפעות של רעלים C. difficile על בפתוגנזה 9,10. עם זאת, CDI במודל אוגר תוצאת שיעורי תמותה גבוהים ואינו להיות קרוב ככל האפשר גילויי מחלה הפנימיים הכרוניים שניתן הנצפים באנשים לוקים 10,11 CDI. בהתבסס על הזמינות והנגישות מגיבה של פלטפורמות murine במחקר, במודל של עכברים של CDI רלוונטי.
בשנת 2008, במודל של עכברים חזק של CDI הוקם על ידי טיפול בעכברים עם קוקטייל אנטיביוטי במי שתייה (kanamycin, גנטמיצין, colistin, metronidazole, ו ונקומיצין) במשך 3 ימים ואחריו זריקת intraperitoneal של קלינדמיצין 12. עכברים שניתנו זה רגיש קוליטיס CDI והחמור. לִסְמוֹךing על מינון הבידוד מנוהל, מגוון של שלטים קטלניים קליניים ניתן לצפות באמצעות מודל זה. מאז הפעם, משטרי אנטיביוטיקה שונים נחקרו המשנים את החיידקים במעיים בעכברים, הפחתת התנגדות קולוניזציה עד לנקודה שבה C. difficile יכול ליישב את מערכת העיכול (הנסקרת ב Best et al. ו Lawley אנד יאנג) 13,14.
לאחרונה, צפלוספורין קשת רחבה, cefoperazone, בהתחשב במי השתייה במשך ימים 5 או 10 הופך reproducibly עכברים רגישים 15 CDI. מאז ממשל של צפלוספורינים מהדור השלישי קשורים עם סיכון מוגבר של CDI בבני אדם, השימוש במודל cefoperazone משקף באופן מדויק יותר טבעיים המתחוללים המחלה 16. Cefoperazone שטופל עכברים רגישים difficile ג כבר אתגר בשני נבגי C. difficile ותאי וגטטיבי של מגוון רחב של זנים החל קליניהרלוונטיות ארסיות 17. למרות חלק מהמחקרים המקוריים ניצול תאי צמח C. difficile כצורה זיהומיות, נבגי difficile ג נחשבים במצב העיקרי להעברת מחלה 18.
בעשור האחרון, C. difficile R20291, זן NAP1 / BI / 027, התפתח, גרימת מגיפות של 19,20 CDI. אנחנו בקשנו לקבוע את המסלול הקליני של מחלה, כאשר עכברים שטופל cefoperazone הותקפו עם הזן קליני הרלוונטי וגנטי-צייתן C. difficile, R20291. פרוטוקול זה מפרט את המהלך הקליני, כולל ירידה במשקל, קולוניזציה חיידקית, cytotoxicity רעלן, ושינויים histopathological במערכת העיכול של עכברים תיגר עם נבגים R20291 C. difficile. בסך הכל, מודל העכבר הזה מוכיח להיות פלטפורמה ניסיונית ערך עבור CDI המתקרבות מחלות אנושיות. ולכן יכול להיות מנוצל במודל עכבר מאופיין זה, לאמוד את השפעתושל הרפוי רומן על השיפור של מחלה קלינית ועל השיקום של התנגדות קולוניזציה נגד difficile ג.
Protocol
Representative Results
Discussion
This protocol characterizes the clinical course, including weight loss, bacterial colonization, toxin cytotoxicity, and histopathological changes in the gastrointestinal tract, of antibiotic-treated mice challenged with C. difficile R20291 spores. There are several critical steps within the protocol where attention to detail is essential. Accurate calculation of the C. difficile spore inoculum is critical. This calculation is based on the original C. difficile spore stock enumeration, which sho…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Trevor Lawley at the Wellcome Trust Sanger Institute for C. difficile R20291 spores and James S. Guy at the North Carolina State University College of Veterinary Medicine for Vero cells, both utilized in this manuscript. Animal histopathology was performed in the LCCC Animal Histopathology Core Facility at the University of North Carolina at Chapel Hill, with special assistance from Traci Raley and Amanda Brown. The LCCC Animal Histopathology Core is supported in part by an NCI Center Core Support Grant (2P30CA016086-40) to the UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. We would also like to thank Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie, and Cassie Schumacher for helpful discussions on the Vero cell cytotoxicity assay protocol. JAW is funded by the Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training grant T32OD011130 by NIH. CMT is funded by the career development award in metabolomics grant K01GM109236 by the NIGMS of the NIH.
Materials
| #62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner | SSS Navigator | 48027 | This product will require dilution as recommended by the manufacturer |
| 0.22 μm filter | Fisherbrand | 09-720-3 | Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | Needs to be heated in water bath at 37C prior to use |
| 0.4% Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| 1% Peniciilin/Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| 10% heat inactivated FBS | Gibco | 16140-071 | Needs to be heated in water bath at 37C prior to use |
| 1ml plastic syringe | BD Medical Supplies | 309628 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 2 ml Micro Centrifuge Screw Cap | Corning | 430917 | |
| 96 well cell culture flat bottom plate | Costar Corning | CL3595 | |
| 96 well filter plate | Millipore | MSGVS2210 | |
| Adhesive Seal | ThermoScientific | AB-0558 | |
| Bacto Agar | Becton Dickinson | 214010 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Bacto Proteose Peptone | Becton Dickinson | 211684 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Cefoperazone | MP Bioworks | 199695 | |
| Cefoxitine | Sigma | C47856 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Clostridium difficile Antitoxin Kit | Tech Labs | T5000 | Used as control for Vero Cell Assay |
| Clostridium difficile Toxin A | List Biological Labs | 152C | Positive control for Vero Cell Assay |
| D-cycloserine | Sigma | C6880 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Distilled Water | Gibco | 15230 | |
| DMEM 1X Media | Gibco | 11965-092 | Needs to be heated in water bath at 37C prior to use |
| Fructose | Fisher | L95500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Hemocytometer | Bright-Line, Sigma | Z359629 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | Part of TCCFA plates (see below) |
| MgSO4 (anhydrous) | Sigma | M2643 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Millex-GS 0.22 μm filter | Millex-GS | SLGS033SS | Filter for TCCFA plates |
| Na2HPO4 | Sigma | S-0876 | Part of TCCFA plates (see below) |
| NaCl | Fisher | S640-3 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Number 10 disposable scalpel blade | Miltex, Inc | 4-410 | |
| PCR Plates | Fisherbrand | 14230244 | |
| Plastic petri dish | Kord-Valmark Brand | 2900 | |
| Sterile plastic L-shaped cell spreader | Fisherbrand | 14-665-230 | |
| Syringe Stepper | Dymax Corporation | T15469 | |
| Taurocholate | Sigma | T4009 | Part of TCCFA plates (see below) |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | 10977-015 | |
| C57BL/6J Mice | The Jackson Laboratory | 664 | Mice should be 5-8 weeks of age |
| Olympus BX43F light microscope | Olympus Life Science | ||
| DP27 camera | Olympus Life Science | ||
| cellSens Dimension software | Olympus Life Science |
References
- Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile Infection in the United States. New England Journal of Medicine. 372, 825-834 (2015).
- Gerding, D. N., Lessa, F. C. The epidemiology of Clostridium difficile infection inside and outside health care institutions. Infect Dis Clin North Am. 29, 37-50 (2015).
- Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin Infect Dis. 55, 88-92 (2012).
- Kociolek, L. K., Gerding, D. N. Breakthroughs in the treatment and prevention of Clostridium difficile infection. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
- Kelly, C. P., LaMont, J. T. Clostridium difficile–more difficult than ever. N Engl J Med. 359, 1932-1940 (2008).
- Louie, T. J., et al. Fidaxomicin versus vancomycin for Clostridium difficile infection. N Engl J Med. 364, 422-431 (2011).
- Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L., Kasper, D. L. Clindamycin-associated colitis due to a toxin-producing species of Clostridium in hamsters. The Journal of infectious diseases. 136, 701-705 (1977).
- Kelly, M. L., et al. Improving the reproducibility of the NAP1/B1/027 epidemic strain R20291 in the hamster model of infection. Anaerobe. , (2016).
- Kuehne, S. A., et al. Importance of toxin A, toxin B, and CDT in virulence of an epidemic Clostridium difficile strain. The Journal of infectious diseases. 209, 83-86 (2014).
- Bartlett, J. G., Onderdonk, A. B., Cisneros, R. L. Clindamycin-associated colitis in hamsters: protection with vancomycin. Gastroenterology. 73, 772-776 (1977).
- Chen, X., et al. A mouse model of Clostridium difficile-associated disease. Gastroenterology. 135, 1984-1992 (2008).
- Lawley, T. D., Young, V. B. Murine models to study Clostridium difficile infection and transmission. Anaerobe. 24, 94-97 (2013).
- Best, E. L., Freeman, J., Wilcox, M. H. Models for the study of Clostridium difficile infection. Gut Microbes. 3, 145-167 (2012).
- Reeves, A. E., et al. The interplay between microbiome dynamics and pathogen dynamics in a murine model of Clostridium difficile Infection. Gut Microbes. 2, 145-158 (2014).
- Owens, R. C., Donskey, C. J., Gaynes, R. P., Loo, V. G., Muto, C. A. Antimicrobial-associated risk factors for Clostridium difficile infection. Clin Infect Dis. 46, 19-31 (2008).
- Theriot, C. M., et al. Cefoperazone-treated mice as an experimental platform to assess differential virulence of Clostridium difficile strains. Gut Microbes. 2, 326-334 (2011).
- Martin, J. S., Monaghan, T. M., Wilcox, M. H. Clostridium difficile infection: epidemiology, diagnosis and understanding transmission. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2016).
- Connor, J. R., Johnson, S., Gerding, D. N. Clostridium difficile infection caused by the epidemic BI/NAP1/027 strain. Gastroenterology. 136, 1913-1924 (2009).
- He, M., et al. Emergence and global spread of epidemic healthcare-associated Clostridium difficile. Nat Genet. 45, 109-113 (2013).
- Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. Journal of AOAC International. 94, 618-626 (2011).
- Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr Protoc Microbiol. , (2009).
- Edwards, A. N., Suarez, J. M., McBride, S. M. Culturing and maintaining Clostridium difficile in an anaerobic environment. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50787 (2013).
- George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J Clin Microbiol. 9, 214-219 (1979).
- Knoblaugh, S., Randolph-Habecker, J., Rath, S., Dintzis, S. M. . Comparative Anatomy and Histology. , 15-40 (2012).
- Ammerman, N. C., Beier-Sexton, M., Azad, A. F. Growth and maintenance of Vero cell lines. Curr Protoc Microbiol. , (2008).
- Theriot, C. M., et al. Antibiotic-induced shifts in the mouse gut microbiome and metabolome increase susceptibility to Clostridium difficile infection. Nat Commun. 5, 3114 (2014).
- Koenigsknecht, M. J., et al. Dynamics and establishment of Clostridium difficile infection in the murine gastrointestinal tract. Infect Immun. 83, 934-941 (2015).
- Theriot, C., Bowman, A., Young, V. Antibiotic-Induced Alterations of the Gut Microbiota Alter Secondary Bile Acid Production and Allow for Clostridium difficile Spore Germination and Outgrowth in the Large Intestine. mSphere. 1, 00045 (2016).
- Xiao, L., et al. A catalog of the mouse gut metagenome. Nature biotechnology. 33, 1103-1108 (2015).
- Leslie, J. L., et al. Persistence and toxin production by Clostridium difficile within human intestinal organoids result in disruption of epithelial paracellular barrier function. Infect Immun. 83, 138-145 (2015).
- Stabler, R. A., et al. Comparative genome and phenotypic analysis of Clostridium difficile 027 strains provides insight into the evolution of a hypervirulent bacterium. Genome Biol. 10, 102 (2009).
- Valiente, E., Dawson, L. F., Cairns, M. D., Stabler, R. A., Wren, B. W. Emergence of new PCR ribotypes from the hypervirulent Clostridium difficile 027 lineage. J Med Microbiol. 61, 49-56 (2012).
