A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.
This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized ‘lysine’ and guanido functionalized ‘arginine’ peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.
ペプトイド(またはポリNは、グリシン-置換)ペプチドに類似の特性を提供し、そのようなものとして、ますます医薬品や材料の用途のために検討されているペプチド模倣物のクラスです。ペプチドにおいて、各アミノ酸の側鎖は、アミド主鎖のα炭素に接続されています。ペプトイド、側鎖は、主鎖の窒素原子上にシフトされます。重要なことは、これは、ペプトイドをタンパク質分解に対してより高い耐性を提供します。
ペプトイドは、一般的に1。Zuckermann ら、ペプトイドモノマーが固体支持体と第一級アミンを用いて、ハロゲンのその後の変位に取り付けられたアミン官能の連続ハロアセチルによって構築することができますによって開拓サブモノマー法を用いて合成される当社グループは、最近開発されましたリジンとアルギニン型ペプトイド残基をfに同じペプトイドの配列内に含まれることができるようにするには、このサブモノマー法への適応IRST時間は2ペプトイド合成にこの手動の固相アプローチは、研究室の大多数のため、それがアクセスできるように、市販の試薬および共通実験装置を使用しています。ペプトイドは、グラム陰性菌、多くの公知の抗菌性ペプチドに匹敵するグラム陽性細菌および真菌種の広い範囲に対して有望な活性を有することが示されている。3-9
私たちの仕事では、ペプトイドは顧みられない熱帯病のリーシュマニア症の治療のための新規抗感染化合物として使用されてきた。5,10リーシュマニア症は、世界80カ国以上で流行している、1200万人が世界的に感染していると推定されている。11この疾患は、サシチョウバエの咬傷によって送信される寄生原虫によって引き起こされる。 リーシュマニア種は皮膚リーシュマニア症、粘膜に瘢痕および損傷につながる条件、または生命を脅かす内臓レイを引き起こす可能性があります致命的な臓器損傷を引き起こすhmaniasis。いいえワクチンは、この病気のために現在利用可能ではないと既存の治療は、重篤な副作用を有する薬物の小さな数に依存しています。また、既存薬に対する耐性は治療が必死に効果的に将来的にリーシュマニア症を治療するのに必要とされているので、新たに出現し、深刻な問題である。12-16
これらの抗菌剤の用途では、ペプトイドは、多くの場合、カチオン性および疎水性モノマーの混合物と両親媒性であるように設計されている。3,4これは、ペプトイドを細菌細胞への選択性の程度を与える哺乳動物細胞への毒性を減少させる、および分子輸送体としてのそれらの活性を向上させることができ。17-20文献における抗感染ペプトイドの大部分は、専らアミノ官能リジン型モノマーまたはアルギニン型残基のいずれかで構成されているカチオン性側鎖を含みます。カチオン性鎖がAで構成されているペプチド – ペプトイドのキメラ、美濃酸リシンまたはアルギニンは、また活動や毒性に対するカチオン性基の効果を調べるために合成されている。21-25
ポリリジンペプトイドを容易に商業的に入手可能なBoc-保護アミンを用いて合成することができます。ポリアルギニンペプトイドはグアニジニル剤としてピラゾール-1-カルボキサミジンを使用する方法を用いて作製することができると報告した。ペプトイドは樹脂から切断された側鎖のBoc保護を除去した後、18しかし、これが唯一よう、行うことができます配列内のすべてのリジン型残基がアルギニン残基に変換されます。微調整に努力化学物質および化合物の生物学的特性では、二重のカチオン性機能( 例えば 、N LysおよびNのArg)が初めて任意のペプトイドのシーケンスに含まれることを可能にする方法を開発した。2
ここで、我々はTWの合成、精製及び特徴を説明します同じ順序で両方のリジンおよびアルギニン型残基を含む小説ペプトイドO。この方法は、グアニジニル試薬としてピラゾール-1-カルボキサミジンと樹脂上の直交N -BocとN -Dde保護を使用しています。これらのペプトイドの生物学的評価はまた、リーシュマニア・メキシカーナ 、皮膚リーシュマニア症の病原体に対する細胞毒性アッセイに記載されています。これは、二重のカチオン性官能基を有するペプトイドにアクセスするために、それらの生物学的活性を評価するための実用的な方法を提供します。この方法は、将来的にペプトイドコミュニティによって両親媒性ペプトイドの合成を促進することが期待されます。
ペプトイドはますます、このような新規治療薬3-5、細胞送達剤としての用途における化学生物学および医薬品化学の分野内で検討されている18,20および診断ツール29は一般的に、これらの配列はオーバー病原体に対する選択性の程度を提供するためにカチオン性であります哺乳動物の細胞、細胞膜を貫通し、また水性系における溶解性を補助する能力。文献にのみリジンまたはアルギニン模倣残基を含むカチオン性ペプトイドの多数の例があります。しかし、現在までに、同じ順序でこれらのカチオン性残基の両方を含有するペプトイドの合成は、適切な合成手順の欠如によって妨げられてきました。ここで説明するプロトコルは、混合カチオン性ペプトイドを効率的に合成することができ、それは両親媒性ペプトイドの生物学的および化学的特性を調節するための経路を提供するように非常に望ましいです。
NT ">我々の方法は、一般的に使用されるサブモノマーペプトイド合成への適応を使用して、同一の配列内のリジンおよびアルギニン型モノマーの両方の付加を可能にする。それを室温カップリングを使用して、この方法が予想されるように、保護基化学確立しました研究グループの大半のために有用であろう。アルギニン型残基のための直交保護を追加するには、保護されていないジアミンは、標準的な変位条件下で添加した後、DDE-OHと60分間のカップリングで保護されています。ジアミンの様々なことができます保護DDE-OHをDMFで十分に溶解し、あるそれぞれ1,6-ジアミノヘキサンにインストールすることが長い6個の炭素を2個の炭素原子、 すなわち、1,2-ジアミノエタンから側鎖を可能にする。使用される非常に効率的かつ選択的な保護基のための第一級アミン。DDE-保護グループが影響を受けない第二級アミンを残し、 例えば 、ペプトイド鎖の保護されていないN末端。30 1つの制限は、シンのすべてです論文は、手動で行われました。しかし、開発のカップリング条件は、自動化ペプチド/ペプトイド合成機で使用するための方法が適して作ることが予想されます。DDE基の樹脂の脱保護ピラゾール-1-カルボキサミジンを使用して樹脂上guanidinylatedできる遊離アミンを残してDMF中2%ヒドラジン溶液を用いて行われます。ピラゾール-1-カルボキサミジンの六同等物およびDIPEAの6同等物は、樹脂上の遊離アミンごとに使用されている( すなわち 、各NのArg型モノマーのための6つの等価物がインストールされます)。再び、この反応はまた、効率的であり、ピラゾール-1-カルボキサミジン試薬は、DMF中で良好な溶解性を有しています。反応の完了は、典型的には、室温で60分後、LC-MSを介して見られます。
サブモノマー法、第一級アミンの広範囲の多様性に起因する条件がEFFIを連結増加させるために最適化される必要があるかもしれないので、変位工程で使用することができますciencyと全体的な生成物の収率や純度。上述の配列については31、特別な条件が成功したカップリングのために必要ではなかったです。しかし、より長い変位倍以上のアミンの濃度は、問題の変位( すなわち 、不十分な求核または立体的に嵩高いアミンなど)を使用することができます。いくつかのアミンは、その場合には、代わりにサブモノマー合成のための前の包括的な方法のようにNメチル-2-ピロリドン(NMP)、又は固相反応のための他の適切な溶媒中でこれらを溶解することを推奨し、DMFで完全に可溶性ではないかもしれません側鎖中に保護されていないヘテロ原子を含有するモノマーを組み込むことペプトイド32で、クロロ酢酸を用いてアセチル化は、他のグループによって有効であることが示されている。33また、他の樹脂は異なるC末端官能でペプトイドを生成するために、この方法で使用することができます。ワング樹脂、2-クロロトリチルクロリド樹脂は日常的に使用されていますペプトイドのサブモノマー合成。例えば、この方法はうまく我々のグループに2-クロロトリチルクロリド樹脂で使用されてきた。2異なる固体支持体のRinkアミドに異なる負荷手順を必要とする(使用される特定の樹脂に依存して)ここで説明これは文献で確認する必要があります合成の前に。
ペプチド合成に類似し、ペプトイドオフ樹脂の最終的な切断のための条件は、特定の配列のために最適化することができます。このプロトコルでは、TFA切断カクテル(スカベンジャーとしてトリイソプロピルシラン及び水)を用いました。ここで提示ペプトイドは、合理的に酸不安定基であるのみBoc保護を含んでいました。保護された残基以下、酸に不安定な保護基の大部分を有する配列の完全な脱保護を確実にするために、より長い切断時間が必要な場合があります( すなわち 、2時間を超える切断時間ははPbfまたは第三-BUを含有する配列のために推奨されていますティルエステル保護されたグループ)。 (例えば、エタンジチオール、または2-メルカプトエタノールは、多くの場合、システイン又はメチオニンなどの硫黄含有側鎖を有するペプチドで使用されるために)代わりのスカベンジャーはまた、特殊な側鎖のために使用することができます。
提示された生物学的アッセイは、異なる細胞株に適合するように変更することができる標準的な細胞毒性試験です。各96ウェルプレートは、得られた結果の信頼性を可能にするのに十分なコントロールを含むべきであることに留意することが重要です。それは、病気を治療するために使用される公知の薬剤であり、これはアッセイのため、化合物ストックを作製するために使用される溶媒であるようにDMSOを陰性対照として使用され、この場合には、アムホテリシンBを正の対照として使用します。他の細胞株が使用されている場合、代替の、適切なコントロールが得られ、使用前に検証されるべきである。L.メキシカーナ1時間100と2μMの濃度でペプトイドとインキュベートされ、次いで、寄生虫/ペプトイド溶液が希釈されます( すなわち、ウェルは、最初は100μMペプトイドストックで10μMに希釈された)一晩のインキュベーションのための10の要因。
細胞生存率の試薬は、アッセイの終わりに、各ウェル(総ウェル容積の10%)に添加します。目に見える色の変化はありません実行可能な寄生虫(青)、生存寄生虫の中間数との間のスペクトルを有する生存可能な寄生虫(ピンク)、対照ウェルとウェルの間に見られています。蛍光は、生細胞の数に比例し、細胞の代謝活性に対応します。レサズリン色素(非蛍光)、代謝的に活性な細胞における還元反応により蛍光レゾルフィンに変換される。このアッセイでは34、細胞生存率の試薬とのインキュベーション時間は、Lのために最適化されていますメキシカーナ 。プレートは、(例えば、この方法を使用することもできる異なる細胞濃度で、または異なる細胞株を播種するために生存性試薬とのインキュベーション時間は変化するであろう)は、哺乳動物細胞を用いました。使用される正確なプレートリーダーに依存し、考慮事項は、蛍光測定が行われる前に行う必要があります。ウェル内の気泡は、正確な測定値を取ることができることを確認するために除去されるべきです。いくつかのプレートリーダーは、平底96ウェルプレートが使用される場合には、プレートの底部から読み出します。他のマシンは、プレートの上部から読み取ることができるので、プレートの蓋は、測定前に除去されるべきです。
最後に、将来的には、このプロトコルは、並列に多数の配列を作ることが可能な自動合成と適合性であってもよいです。さらに、環状ペプトイドの合成は、この方法を用いても可能です。このプロトコルは、材料または医薬品の分野を含む多くの用途において有用であり得るリジンおよびアルギニン系モノマーの両方を有する新規なペプトイド骨格にアクセスするために使用することができる実用的な合成法で研究者に提供すべきです。
The authors have nothing to disclose.
私たちは、財政支援のための工学・物理科学研究会議(EPSRC)(HLB)をお願いいたします。また、この手順の撮影中に彼女の援助のためSridéviMaalika Ramanoudjameに感謝します。
Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits | Crawford Scientific | 12131017 and 12131015 | 20 mL and 6 mL cartridges used in this preparation |
Trifluoroacetic acid | Tokyo Chemical Industry (Europe) | T0431-100g | >98%; CAUTION can cause severe burns and respiratory irritation |
N-N'-diisopropylcarbodiimide | Sigma Aldrich | 38370-100ML | >98%; CAUTION hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation |
Dimethylformamide | Fischer Scientific | 10346180 | HPLC grade; CAUTION suspected teratogen |
Acetonitrile | Fischer Scientific | 10407440 | HPLC grade |
Dichloromethane | Fischer Scientific | 10354263 | 99.8%; CAUTION suspected carcinogen |
Bromacetic acid | Sigma Aldrich | 17000-100G | >99%; ; CAUTION causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract |
(S)-(-)-alpha methylbenzylamine | Sigma Aldrich | 115568-100G | 98%; CAUTION harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer |
N-Boc 1,4 diaminobutane | Tokyo Chemical Industry (Europe) | A1373-25g | >98%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer |
N-Boc 1,2 diaminoethane | Tokyo Chemical Industry (Europe) | A1371-25g | >97%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer |
1,2 diaminobutane | Sigma Aldrich | D13208-100G | 99%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer |
1,4 diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550-250ML | >99.5%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer |
1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl | Sigma Aldrich | 402516-10G | as HCl salt; CAUTION harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage |
Hydrazine monohydrate | Sigma Aldrich | 207942-5G | reagent grade; CAUTION suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes |
2-acetyl dimedone | Novabiochem | 8510150005 | Dde-OH |
Rink Amide resin | Novabiochem | 8551190005 | 100-200 mesh, high loading |
Piperidine | Sigma Aldrich | 411027-1L | >99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects |
Triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781-50G | 98%; CAUTION flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation |
alamarBlue | ThermoFischer | DAL1025 | Not classified as hazardous |
Schneider's Insect Medium | Sigma Aldrich | S9895-1L | Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays |
96 well plates | VWR | 734-1793 | Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated |
Solvent reservoirs | VWR | 613-1182 | Used with multi channel pipette |
Multi channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | |
Pipette tips | Starlab Group | S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810 | Volume of tip dependent on pipette used. 10 µL, 10 – 200 µL and 1000 µL recommended for assays |
25 cm3 cell culture flasks | VWR | 734-2312 | |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 525-0791 | |
dimethylsulphoxide (molecular biology grade) | Sigma Aldrich | D8418-50ML | Not classified as hazardous |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | ThermoFischer | 10082139-100mL | Gibco |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer | 15140148-20mL | Abbreviation: P/S |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | 46006-100mg | Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard |