JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

Published: November 02, 2016
doi:
10.3791/54750
, ,
1Department of Chemistry,Durham University, 2School of Medicine, Pharmacy and Health,Durham University

Summary

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Abstract

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized ‘lysine’ and guanido functionalized ‘arginine’ peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

Introduction

Peptoidler (ya da poli N Glycines ikame edilmiş) peptidler benzer özelliklere sunmak ve gibi giderek tıbbi ve malzemeler uygulamalar için araştırılmaktadır peptid-taklitlerinin sınıfıdır. peptidler, her bir amino asidin yan zinciri amid omurgasının α-karbon bağlıdır; peptoidler yan zincirler omurganın azot atomu üzerine kaydırılır. En önemlisi, bu peptoidler proteolize karşı daha büyük direnç verir.

Peptoidler genellikle 1. Zuckermann ve ark., Peptoid monomerler katı bir destek ve bir birincil amin kullanılarak halojen sonucu, müteakip değiştirme bağlı bir amin işlevselliği sıralı haloacetylation inşa edilebilir öncülük submonomer yöntemi kullanılarak sentezlenir grubumuz en son geliştirmiştir Bu submonomer yöntemine uyarlama lizin ve arginin tipi peptoid kalıntıları f aynı peptoid dizisi içinde yer sağlamak içinirst zaman. 2 sentezini peptoid Bu manuel katı-faz yaklaşımı laboratuvarlarının çoğunda erişilebilir hale getirmek, ticari olarak mevcut reaktifler ve ortak laboratuar ekipmanları kullanmaktadır. Peptoidler Gram negatif bakterilerin çok sayıda bilinen antimikrobiyal peptitler karşılaştırılabilir Gram pozitif bakteri ve mantar türlerinin bir çok çeşitli karşı da umut verici aktivitelere sahip olduğu gösterilmiştir. 3-9

Çalışmamızda, peptoidler ihmal tropikal hastalık leishmaniasis tedavisi için yeni anti-enfektif bileşikler olarak kullanılmıştır. 5,10 Leishmaniasis dünya çapında 80'den fazla ülkede endemiktir ve 12 milyondan fazla insan küresel enfekte olduğu tahmin edilmektedir. 11 hastalık kum sineği ısırmasıyla iletilir protozoon parazitler neden olur. Leishmania türlerinin kutanöz leishmaniasis, mukoza zarlarında yara ve hasar yol açan durumun, ya da hayatı tehdit edici viseral, giyim neden olabilirölümcül organ hasarına neden olan hmaniasis. Resim aşısı, bu hastalık için şu anda mevcut olan ve mevcut tedavilerin ciddi yan etkileri olan ilaçların az sayıda kullanır. Buna ek olarak, mevcut ilaçlara direnç çok yeni tedaviler umutsuzca etkili bir gelecekte leishmaniasis tedavisi için gerekli olan gelişmekte olan ve ciddi bir sorundur. 12-16

Bu antimikrobik uygulamalarda, peptoidler genellikle katyonik ve hidrofobik monomerlerin bir karışımı ile amfipatik olarak tasarlanmıştır. 3,4 Bu peptoidler bakteri hücreleri yönelik seçicilik derecesi elde memeli hücrelerine toksisiteyi azaltmak ve moleküler taşıyıcı olarak etkinliği geliştirmek için . 17-20, literatürde, anti-enfektif peptoidler çoğunluğu özel bir amino işlevselleştirilmiş lizine monomerleri ya da arginin tipi kalıntıları ya oluşmaktadır katyonik yan zincirlerine sahiptir. Katyonik zincirleri oluşan peptid-Peptoid kimeralar,mino asitler lisin ya da arginin, aynı zamanda, etkinlik ve toksisite, katyonik gruplar etkisini incelemek üzere sentezlenmiştir. 21-25

Poli-lisin peptoidler ticari olarak satılan Boc-korumalı amin kullanılarak sentezlenebilir. Poli-arginin peptoidler bir guanidinylation maddesi olarak pirazol-1-karboksamidin kullanan bir yöntem kullanılarak yapılabilir rapor etmiştir. Peptoid çıkarılan yan zincirler üzerinde reçine ve Boc koruma ayrıldı sonra 18 Ancak, bu şekilde, üstlenilebilir dizisi içindeki her lisin tipi Tortu, bir arginin kalıntısının dönüştürülür. Ince ayar için bir çaba olarak bileşiklerin kimyasal ve biyolojik özellikleri, biz (örneğin, N-Lys ve N Arg) ilk kez belirli bir Peptoid dizisi içine dahil edilmesi için ikili katyonik özelliğe izin veren bir yöntem geliştirdi. 2

Burada, TW sentezi, saflaştırılması ve karakterizasyonu açıklanmaktadıraynı sırayla hem lizin ve arginin-tipi artıklarını ihtiva yeni peptoidler o. Yöntem, bir guanidinylation reaktif olarak pirazol-1-karboksamidin olan reçine üzerinde dik N-Boc ve N -Dde koruması kullanır. Bu peptoidler biyolojik değerlendirmesi de Layişmanya mexicana Deri layişmanyozun etkeni karşı sitotoksisite deneyleri tarif edilmektedir. Bu ikili katyonik işlevselliği ile peptoidler ulaşmak için ve bunların biyolojik aktivitesini değerlendirmek için pratik bir yöntem sağlar. Yöntem, ileride Peptoid topluluğu tarafından amfipatik peptoidler sentezini yardım edeceği beklenmektedir.

Protocol

Peptoidler 1. Katı faz sentezi Not: peptoidler el katı faz Peptoid sentezi submonomer prosedürü kullanılarak sentezlendi. Bu yöntem, yüksek bağlanma özelliğine ve iyi bir son ürün verimi sağlar. Katı faz üzerinde sentez, reaksiyona giren maddelerin fazlasının her adımın sonunda kolayca çıkarılabilir ve yöntem, aynı içinde yer farklı işlevselleştirilmiş katyonik monomerler (örneğin, arginin tipi ve lizin tip kalıntıları) sağlanması için burada modifiye edilmiş sağlar dizisi. 1,2 Doğrusal peptoid sentezi Dikkat: sentezini başlamadan önce güvenlik değerlendirmelerini yürütmek. Davlumbaz bütün tepkileri yürütmek ve uygun (yani, tek kullanımlık nitril eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü) olarak yeterli kişisel koruyucu ekipman giyin. Aşağıdaki reaktifler ve çözücüler kullanıldığında özellikle dikkat edin. Dimetilformamid (DMF), şüpheli bir teratojen ve ddiklorometan kullanılarak arıtılmıştır (DCM) kanserojen. N, N 'diizopropilkarbodiimid (DIC) ve piperidin solunum inhalasyon yoluyla, göz, deri için tehlikeli ve cilt hassasiyete neden olabilir. Hidrazin solunması halinde, ölümcül bir şüpheli kanserojen ve ciltte veya gözlerde ciddi yanıklara neden olur. Bromoasetik asit de deri, göz ve solunum yollarında zararlı ve temas üzerine yanıklara neden olabilir. Trifloroasetik asit (TFA) uçucu bir sıvıdır ve şiddetli yanıklar yüzden dikkatli kullanın neden olabilir. Ağır iş eldivenleri tavsiye edilir. İki cam hamuru ile sınırlanmış bir 20 ml polipropilen tepkime kabına 0.12 g Fmoc-korumalı Rink Amide reçinesi (0.1 mmol, tipik bir yükleme 0.7 mmol / g). reçineyi kabartmak ve oda sıcaklığında en az 60 dakika süre ile beklemeye gemiyi terk 5 ml dimetilformamid (DMF) ekleyin. katı-faz ekstraksiyon vakum platformunu kullanarak DMF boşaltın. Şişen reçineye Fmoc grubunun korumasının kaldırılması için 2 mi piperidin solüsyonu (DMF v% 20 / h). üzerinde bir kap yerleştirinoda sıcaklığında (450 rpm) ve bir çalkalama platformu 5 dakika sallayın. Vakum istasyonu aracılığıyla çözüm çıkarın. 2 mi piperidin çözeltisi ile Fmoc koruması giderildikten tekrar edin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca sallayın. daha önce olduğu gibi çözüm boşaltın. 2 mL DMF ilave edilmesi ve 30 saniye için reçine karıştırılarak reçine yıkanır. DMF boşaltın ve üç kez daha tekrarlayın. Asetilasyon için, bromoasetik asit çözeltisi (DMF içinde 0,6 M) ve 1 ml ilave 0.2 ml N, N 'diizopropilkarbodiimid çözeltisi (DIC,% 50 DMF içinde hac / hac). Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca çalkalanır, reaksiyon kabı bırakın. çözüm boşaltın ve 2 ml DMF üç kez reçine yıkayın. yer değiştirme, amin çözeltisi (DMF içinde 1,5 M) 1 ml. Oda sıcaklığında 60 dakika süre ile reçineyi çalkalayın. çözüm boşaltın ve 2 ml DMF üç kez reçine yıkayın. Bir arginin-tipi monomer eklemek için, adım 1.7 izleyin. İstenen Peptoid sekansına bağlı olarak, farklı aminlereklenecektir. Tekrarlayın 1.1.4 ve 1.1.5 adımları. Guanidin işlevselleştirilmiş monomer (örneğin, N-Arg) dahil etmek için, reçineye korumasız diamin çözeltisi (DMF içinde 1,5 M) 1 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca sallayın. çözüm boşaltın ve 2 ml DMF üç kez reçine yıkayın. Serbest primer amine Dde grubu ilave etmek ve oda sıcaklığında 60 dakika boyunca çalkalanır, 2-acetyldimedone (0.2 g, 0.5 ml DMF içindeki 1 mmol, 10 eşdeğer) ekleyin. çözüm boşaltın ve 2 ml DMF üç kez reçine yıkayın. Arzu edilen sekans gerçekleşene kadar 1.1.7 1.1.4 gibi submonomer sentezi devam edin. reçine yıkama ve üç kez tekrarlamak 2 ml DMF ekleyin. reçine Dde grubu korumasını kaldırmak için, (DMF v / v) 4 ml% 2 hidrazin çözeltisi ilave edilir ve oda sıcaklığında 3 dakika boyunca sallayın. çözüm boşaltın ve üç kez tekrarlayın. çözüm boşaltın ve 2 ml DMF üç t reçine yıkayınimes. Ve N, N-diizopropiletilamin ya da DIPEA (serbest amin başına 6 eşdeğer) DMF (minimum hacimde, N Arg monomer başına yani serbest amin başına 6 eşdeğerleri) pirazol-1-karboksamidin ekleyin ve 60 dakika boyunca oda sıcaklığında çalkalayın . boşaltın ve 2 ml diklorometan ile üç kez reçine yıkayın. daha sonra reçine bölünmesi (bölüm 2) kadar saklanabilir, 10 dakika boyunca havada kurumaya reçine bırakın. sentezini duraklatmak için, üç kez DMF 2 ml reçine yıkayın. 2 mi DMF ekleme, sentez kap tapası ve davlumbaz oda sıcaklığında bırakın. NOT: Sentez herhangi deplasman adım (diketopiperazinlerin ikinci deplasman aşama haricinde oluşabilir) sonra durdurulmuş olabilir. Yan zincir koruma açma ve reçineden ayrılması displa sonra sentez sırasında herhangi bir noktada sentez (saflık ve kütle) ilerleyişini kontrol etmek için bir test Cleave TaahhütÇimento adım eklenmesi veya son sekans Dde-koruma grubunun veya sonrasında çıkarma yapılmıştır. Yeni 8 ml polipropilen sırlı kartuş içine reaksiyon kabından yaklaşık 10 reçine boncuk aktarın. Trifloroasetik asit yarılma kokteyli, 1 ml ilave edilir (% 95 TFA,% 2.5 H2O,% 2.5 triizopropilsilan içeren) ve oda sıcaklığında 90 dakika boyunca sallayın. yuvarlak tabanlı bir şişeye 10 ml fritli reaksiyon teknesi kullanılarak reçineden TFA yarılma kokteyli, filtre. Bir dönen buharlaştıncı kullanarak yarılma kokteyli, buharlaştırın ve LC-MS veya analitik HPLC sunulmak üzere 1 mi, asetonitril / su içindeki yağ çözülür. Son bölünme için sentez için kullanılan aynı fritli polipropilen Reaksiyon kartuş TFA yarılma kokteyli, (% 95 TFA,% 2.5, H2O,% 2.5 triizopropilsilan) 4 ml ilave edilir ve bir kap kapağı. Oda sıcaklığında 90 dakika boyunca sallayın. filtre inciyuvarlak tabanlı bir şişeye 50 ml fritli reaksiyon teknesi kullanılarak reçineden e TFA bölünmesi kokteyli. Bir dönen buharlaştıncı kullanarak yarılma kokteyli, buharlaştırın. TFA uzaklaştırıldıktan sonra, ürün, bir yağ halinde elde edilmelidir. Bu ham petrolden TFA çıkışına yardım etmesi için, 2 mi susuz dietil eter ilave edilir ve Peptoid çökeltilmesi gerekir. Her iki durumda da pipetle dietil eter uzaklaştırılmış ve atın veya bir döner buharlaştırıcı kullanılarak buharlaştırılır. Tekrarlama dietil eter yağış üç kez. 10 mi asetonitril / asitleştirilmiş su çözeltisi içinde, ham peptoid çözülür (su v içinde% 50 asetonitril,% 0.1 TFA / hac). önceden tartılmış bir kaba transfer, 20 ° C'de dondurma ve bir kuru toz liyofilize edin. 2. Karakterizasyonu ve Arıtma Not: Peptoid sentezi izlenebilir ve bir C 18 sütunu ve EL kullanılarak analitik ters fazlı HPLC ile değerlendirildi son Peptoidelektrosprey sıvı kromatografisi kütle spektrometrisi (LC-MS). LC-MS için bütün çözücü HPLC çözücüleri, taze hazırlanmalıdır. Analitik HPLC Küçük bir cam şişe içinde peptoid 1 mg tartılır. çözülür ve su ile 1 ml ye tamamlanır asetonitril minimum hacim. Peptoid tamamen çözülmüş olduğundan emin olun. Analitik HPLC 10 ul enjekte edilir (önerilen gradyanı 0-30 dakika üzerinde% 100 çözücü B'ye burada çözücü A =% 95 su,% 5 asetonitril,% 0.05 TFA ve çözücü B =% 95 asetonitril,% 5 su,% 0.03 TFA) üreticinin talimatlarına göre. 220 nm'de UV spektrumu gözünüzde canlandırın. ESI-LC-MS Adım 2.1.1 olarak 1 mg / ml Peptoid çözüm olun. Hedef peptoid moleküler ağırlığı imalatçı talimatları doğrultusunda, mevcut olup olmadığını belirlemek için LC-MS elektrosprey 1 ul enjekte edilir. Bir PEPT kullanarak Peptoid dizisinin hedef kitle kontrolhesap ilgili talimatlar uyarınca oid hesap. 26 Bu web programı da kütle spektrumunda görülen herhangi bir silme / ekleme ürünlerinin atanmasına olanak verir. 26 Hazırlayıcı ters fazlı HPLC asitleştirildi 2 ml su / asetonitril (% 95 su,% 5 MeCN,% 0.1 TFA), ham peptoidler çözülür ve üreticinin protokolü kullanılarak preparatif RP-HPLC ile saflaştırılması. Analitik HPLC ve sütun boyutlara bağlıdır enjekte edilen miktar, elde edilen elüsyon zaman derecesi belirlenir. 220 nm'de ayarlanmış bir detektör kullanılarak görselleştirme. 15 ml santrifüj tüplerine fraksiyonlar 20 ° C ve liyofilize donma toplayın. LC-MS ve imalatçının protokolüne göre, analitik HPLC kullanılarak fraksiyonların yeniden analiz edin. Saflaştırılmış fraksiyonlar bir araya toplamaktadır. Leishmania mexicana Parazitler karşı 3. Biyolojik Test Caution. Güvenlik değerlendirmeleri sentezini başlamadan önce yapılmalıdır Leishmania mexicana önce test başlangıç için yerinde olmalıdır İngiltere ve yeterli kontrol önlemleri bir tehlike grup 2 patojen sınıflandırılır. Tüm çalışmalar sınıf 2 mikrobiyolojik güvenlik kabini ve uygun (yani, nitril eldiven, koruyucu gözlük ve laboratuvar önlüğü) olarak giyilen yeterli kişisel koruyucu ekipman yapılmalıdır. Parazitlerin Alt kültür 30 saniye için 37 ° C su banyosu içinde şişeyi yerleştirerek 1 mi -150 ° C Donmuş stokun Leishmania mexicana M379 Defrost. Olmayan bir havalandırmalı kapak ile 25 cm3 hücre kültür şişesi içinde (% 15 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş, pH 7.0'da) 10 mi Schneider Böcek ortamına stok solüsyonu aktarın. 72 saat boyunca 26 ° C'de inkübe edin. durumunu kontrol etmek için mikroskop altında parazitleri (400X büyütme) inceleyin. they böcek sahne promastigotları, birçok bölünen hücreler ile log fazında procyclic formlar olmalıdır. 5 x 10 5 parazit / ml her üç günde bir konsantrasyona alt kültürlenmesi parazitlerin procyclic promastigotlar koruyun. Neubauer geliştirilmiş hemasitometre kullanarak hücre sayımı. L. dönüştürülmesi memeli sahne aksenik amastigot formu 27 içine mexicana böcek sahne Gün 0: (% 15 ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş, pH 7.0'da) Schneider Böcek ortamında 5 x 10 5 parazit / ml log aşaması parazit 10 mi kültür Hazırlama 25 cm3 hücrede bir havalandırma delikleri olmayan kapaklı kültür şişesi. 48 saat boyunca 26 ° C'de inkübe edin. 3. Gün: 5 dakika boyunca 447 x g'de 50 ml'lik bir santrifüj tüpüne ve santrifüj aktarın 10 ml kültür. eski orta dökün ve% 20 h ile desteklenmiş, pH 5.5'te 10 mi Schneider böcek orta (ekleme) Cenin sığır serumu ve% 1 penisilin / streptomisin, akşam yemeği inaktive. Yavaşça bir pipet kullanarak yeni ortamda parazitlerin pelletini. Neubauer geliştirilmiş hemasitometre kullanarak parazitlerin sayısını. 25 cm3 hücre kültür şişesine pH 5.5, orta ve transfer 5 x 10 5 parazit / ml 'lik bir konsantrasyona kadar seyreltilir. Yaklaşık 6 gün boyunca 26 ° C'de inkübe edin. 9. Gün: Bir mikroskop (400X) kapsamında parazitleri inceleyin. Bu olmayan replike enfeksiyöz metacyclic promastigot aşamasına olmalıdır. Neubauer geliştirilmiş hemasitometre kullanarak parazitlerin sayısını. PH 5.5 ortamı ile 5 x 10 5 parazit / ml 'lik bir konsantrasyona kadar seyreltilir. Hücre kültürü 10 ml çıkarın ve hücre kültürü şişesine aktarın. 5 gün boyunca 32 ° C'de inkübe edin. 14. Gün: mikroskobu (400X) kapsamında parazitlerin görünümünü kontrol edin. Onlar kamçı karakteri eksik, patojenik amastigot aşamasında olmalıdırpromastigotlarının istic ve tahlil için hazır. L. sitotoksisite deneyi mexicana aksenik amastigotları. Not: peptoidler biyolojik testleri 96 gözlü plakalar içinde gerçekleştirilmektedir, yüksek kapasiteli testler kullanılır. Bu protokol, L. olarak test edilmesinin tanımlamaktadır mexicana aksenik amastigotları fakat özdeş deneyler, aynı zamanda uygun bir ortamda promastigot aşamasıyla parazitler üzerinde gerçekleştirilebilir. 60 dakika süre ile 100 um ve daha sonra bir 10-kat seyreltme takip eden 24 saat için kuluçkalanmıştır – bileşimler 3'ten konsantrasyonlarda parazitler ile inkübe edilir. Sonuçlar Resazurin-bazlı hücre canlılığı çözeltisi (ör AlamarBIue) ile inkübasyondan sonra kuyu floresan ölçüm ile elde edilmiştir. Bileşik stok çözümleri hazırlayın. bir analitik terazi kullanılarak nihai saflaştınlmış Peptoid ürün, 1 mg tartılır. 5 mM'lik bir konsantrasyona kadar moleküler biyoloji sınıf dimetilsülfoksit (DMSO) uygun hacim. 6 ul alikotları olun ve-20 ° C'de dondurun. 100 ila 3 uM, üç kopya halinde 96 oyuklu plakalar (önerilen bir plaka yerleşimi, sonuç bölümünde görülebilir Şekil 6) üzerinde bileşik solüsyonu hazırlayın. En üst üste (ör, A) her bir bileşiğin, 5 mM stok çözeltisi 2 ul ekle. Çok kanallı bir pipet kullanılarak üst sıra (pH 5.5 ve% 20 fetal sığır serumu (FBS),% 1 penisilin / streptomisin (P / s)), taze Schneider böcek orta 48 ul ekle. Diğer tüm satırlara (- F B) 25 ul Schneider Böcek orta ekleyin. Üst satırdan pipet 25 ul çözümü tarafından bir seri seyreltme yürütmek. Aşağıdaki satıra ekleyin ve karıştırın. son 25 ul çözelti atılmalıdır son satırda kadar dilüsyonları yürütmek. üçlü olarak bir negatif kontrol olarak, bir pozitif kontrol ve DMSO (% 2 solüsyon) halinde amfoterisin B (5 mM stoklar) kullanın. Parazit çözüm hazırlayın: Transfer kültürünü bir 50 ml santrifüj tüpüne ve santrifüj de karşı5 dakika boyunca 447 x g. eski orta dökün ve (pH 5.5 ve% 20 FBS,% 1 P / S), 10 ml Schneider böcek orta ekleyin. Yavaşça bir pipet kullanarak yeni ortamda parazitlerin pelet çözülür ve bir Neubauer geliştirilmiş hemasitometre kullanarak saymak. 8 x 10 6 parazitler / ml kültür sulandırmak. 25 ul L ekleme her bir oyuğa mexicana kültürü. 32 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe edin. inkübatör plaka çıkarın ve her kuyudan 40 ul çözüm kaldırmak. 90 uL taze ortam ilave edin ve 32 ° C'de 24 saat boyunca inkübe edilir. her bir oyuğa 10 ul Resazurin-bazlı hücre canlılığı solüsyonu ekleyin. 32 ° C'de 4 saat inkübe edilir. Üreticinin talimatlarına göre, (λ em 600 nm =, λ ex = 540 nm) plaka okuyucu kullanarak floresan ölçmek. (Ortamdan sadece kuyu) ortalama arka plan çıkarılması ve t ile ilgili normalleştirme sonra kuyuların floresan karşılaştırarak verileri analizO kontroller, DMSO'nun.

Representative Results

temsili bir sonuç, iki lisin tipi monomerler ve iki arginin monomerleri Her tarif edilecektir ihtiva eden iki adet 12 Kalıntı peptoidler sentezi ve karakterizasyonu gibi. sitotoksisite tahlilinde Daha sonraki sonuçlar gösterilmiştir. İki peptoidler [(N nArg N SPE N SPE) (N ae N SPE N SPE)] 2 (a) ve [(N hArg N SPE N SPE) (N Lys K SPE N SPE)] 2 (b) sentezlenmiştir kullanılarak 120 mg Rink Amide her (yükleme = 0.79 mmol / g) reçine. Ticari olarak satın alınan tüm tepkin maddeler ile, yukarıda tarif edildiği gibi, tüm asetilasyonu ve değiştirme aşamaları gerçekleştirilmiştir. Bu kalıntıların, aşağıdaki aminler değiştirme aşamasında kullanılmıştır: K SPE (S) – (-) – α-metilbenzilamin, N ae N – (tert-butoksikarbonil) -1,2-diamininoethane, N Lys A ^ – (tert-butoksikarbonil) -1,4-diaminobütan. Arginin türevinin kalıntıları için aşağıdaki korumasız diaminler birleştirildi N hArg 1,4-diaminobutan veya N nArg 1,2-diaminoetan (DDE-OH) 2-acetyldimedone on-reçine koruma eklenmiştir. Bütün sekans, sentezlenmiş sonra, DDE hidrazin koruma kaldırma guanidinylate serbest aminlerin elde edilir. Şekil 1. peptoid yapıları: (a) [(N nArg N SPE N SPE) (N ae N SPE N SPE)] 2 ve (b) [(N hArg N SPE N SPE) (N <stro ng> Lys N spe N SPE)] 2.. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2.. I karışık arginin / lisin peptoidler sentezlemek için kullanılan yöntem. diamin submonomer yönteminde Standart değiştirme aşaması; II. Dde-OH, 90 dakika ilavesi serbest amin korumak; III. Bundan başka ilave submonomer yöntemiyle Peptoid zincirinin uzatılmasına; IV. Dde DMF içerisinde% 2 hidrazin ile korumasının kaldırılması; . DMF pirazol-1-karboksamidin ve DIPEA ile reçine üzerinde serbest amin h Guanidinylation; vi. BOC grubunun reçineden ayrılma ve tamamen korunma asitli ayrılması.large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (A) 154 mg, (b) 163 mg: reçine ve liyofilizasyon bölünme ardından, ham ürün beyaz bir toz olarak elde edildi. en fazla 50 mg enjeksiyonları bir analitik sütun üzerine bir UV detektörü (λ = 250 nm) ile, 250 mm x 10 mm, 5 um LC pompası kullanılarak açıklandığı gibi ürünler RP-HPLC ile saflaştırılmıştır; oranı = 2 ml / dak. Hedef kitle tekabül eden fraksiyonlar bir araya getirilmiş ve beyaz tozlar halinde elde edildi: (a) 54 mg (B) 65 mg,% 90 saf fraksiyonlar> yaklaşık% 30 nihai verir. Saflaştırmadan sonra son bileşik kimliklerin bir UPLC ve fotodiyot dizili bir detektör ile donatılmış bir üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi kullanılarak LC-MS (bakınız Şekil 3) ile doğrulanmıştır. Doğru kütle spektrometrisi t aynı spektrometresi kullanılarak yapılmıştır O [M + 2H] 2+ iyonları. Aşağıdaki şekilde hesaplanan ve gözlenen kitleler yakın anlaşma (Şekil 4) bulundu: (a) hesaplandı = 896,0026 amu, gözlenen = 896,0038 amu; (B) hesaplandı = 952,0691 amu, gözlenen = 952,0730 amu. Saflaştırılmış peptoidler Şekil 3. LC-MS. (A) m / z = 1,792 ve (b) m / z = 1,903. Üst TIC, orta LC-MS spektrumu, 220 nm alt UV kromatogramı nerede. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil peptoidler 4. Doğru kütle spektrometrisi verileri (a) ve (b)."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Ürün saflığı, analitik RP-HPLC ile değerlendirildi (3.5 um bir analitik sütun üzerine, 4.6 mm x 100 mm bir UV detektör ile LC pompa, akış hızı = 1 ml / dakika) ve 220 nm, emme görüntülenmiştir amid omurgası. Şekil 5A ve 5B, bileşikler, homojen olduğunu göstermektedir. Şekil 5. Analitik saflaştırılmış peptoidler HPLC (a) ve (b). 40 ° C'de (A =% 95 H2O,% 5 MeCN, 0.05 ° C'de 30 dakika, kolon fırını içinde gradyan% 0-100 B yoktur % TFA; b.% 95 MeCN,% 5 H2O,% 0.03 TFA) = cl, lütfenBu rakamın büyük halini görmek için buraya ick. Saflaştırılmış peptoidler (a) ve (b) L karşı sitotoksisite deneyleri ile test edilmişlerdir mexicana aksenik amastigotları. L. Dondurulmuş stokları mexicana çözüldü ve deneye hazır amastigot aşamasmda dönüştürülmüştür. 72 saat çözülür ve sonra, parazitler, birçok bölünen hücreler ile log fazında procyclic biçimde böcek aşaması promastigotlar olmalıdır. Bu aşamada parazitler dönüşüm 9. günde. 27 tarif edilen pH ve sıcaklık geçişi kullanılarak amastigot aşamasmda dönüştürülebilir, parazitler replike olmayan enfeksiyon metacyclic promastigot aşamasına geçer. Son olarak 14. günde, parazitlerin promastigotlarının tipik flagella eksikliği patojen amastigot aşamasmda olmalıdır. 28 Bileşiklerin, 5 mM stok çözeltileri, hücre kültürü dereceli DMSO içinde yapılır ve ilgili üç kez test edildisağlam bir veri kümesi sağlamak için iki kez en az toplanmıştır. Temsili 96 oyuklu plaka planı, Şekil 6'da gösterilmiştir. Testin sonunda hücre canlılığı, reaktif, test edilen her konsantrasyonunda parazitlerin kalabilirliğinin hesaplanması için tarif edildiği gibi (bakınız Şekil 7 ölçülmüştür her bir ve floresan ilave edildi ). ED50 değerleri, peptoid (a)> 100 uM ve 37 uM, sırasıyla peptoid (b) olarak hesaplandı. Hata çubukları standart sapma olarak kuyu arasındaki değişimi göstermek, çizilen ve bu çoğu barlar için makul görülebilir. (Pozitif ve negatif kontroller dahil) 2 Peptoid çözümleri üzerinde bir sitotoksisite deneyi için Şekil 6. Temsilcisi 96 plaka planı. + = Orta med (Schneider Böcek Orta pH 5.5,% 20 FBS,% 1 P / S). L. mex. =Med + 8 x 10 6 / ml parazit kültürü. AmphoB = DMSO içinde 5 mM. DMSO içinde peptoid = 5 mM stok çözüm. Boş kuyu steril su içermelidir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. L. karşı sitotoksisite deneyi 7. Sonuçlar Şekil Peptoid kullanılarak mexicana aksenik amastigot parazitler, (a) ve (b). Peptoid (b) (a) her iki bileşikler, doza bağlı bir etkiye sahip olan, uygun bir parazit oranını azaltmada peptoid daha etkili olduğu görülmektedir. Çizilen hata çubukları standart sapma olarak kuyu arasındaki farklılıklar gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Peptoidler artan bu yeni terapötik 3-5 hücre dağıtım maddeler gibi uygulamalarda, kimyasal biyoloji ve tıp kimyası alanlarına olan çalışılmaktadır 18,20 ve tanı araçlarıdır. 29 tipik olarak, bu diziler üzerinde patojenin seçicilik derecesi elde etmek üzere katyonik memeli hücreleri, hücre zarlarından nüfuz ve sulu sistemler içinde çözünürlüğe yardımcı olmak için yeteneği. Literatürde sadece lizin veya arjinin-mimetik artıkları ihtiva katyonik peptoidler sayısız örnekleri vardır. Ancak bugüne kadar, aynı sırada bu katyonik tortularının her ikisini de içeren peptoidler sentezi uygun bir sentetik prosedür eksikliğinden edilmiştir. Burada açıklanan protokol karışık katyonik peptoidler verimli bir şekilde sentezlenebilmektedir sağlar ve amfipatik peptoidler biyolojik ve kimyasal özelliklerini modüle etmek için bir yol sunar gibi son derece arzu edilen bir durumdur.

NT "> Bizim yöntemi yaygın olarak kullanılan submonomer Peptoid sentezine bir uyarlama kullanan aynı dizi içindeki hem lizin ve arginin-monomerleri ilave izin verir. Oda sıcaklığında kavramalar kullanan ve bu yöntemle tahmin edilmektedir, böylece koruyucu grup kimyası kurulan araştırma grubu çoğunluğu için yararlı olacaktır. arginin tipi kalıntısı için ortogonal bir koruma eklemek için, bir korumalı olmayan diamin Dde-OH. diaminlerin çeşitli olabilir ile 60 dakikalık bir kaplin, standart yer değiştirme koşulları altında ilave edildi ve daha sonra korunmaktadır sırasıyla 1,6-diaminoheksan, 1,2-diaminoetan. koruma Dde-OH, DMF içinde de çözünür, yani yüklü uzun 2 karbon ila 6 karbon yan zincirleri sağlar ve çok etkili ve seçici bir koruma grubu için olan kullanılan primer aminler. Dde koruma grubu, etkilenmemiş gibi, Peptoid zincirin korumasız N terminalini ikincil aminler bırakır. 30 bir sınırlama olan syn tümtez elle yapılmıştır; Bununla birlikte, geliştirilmiş birleştirme koşulları otomatik peptid / Peptoid synthesizer ile kullanım için bir yöntem makul hale beklenmektedir.

DDE grupların reçine üzerinde korumanın kaldırılması pirazol-1-karboksamidin kullanılarak reçine üzerinde guanidinylated edilebilir serbest aminlerin bırakmak için DMF içinde% 2 hidrazin çözeltisi kullanılarak yapılır. Pirazol-1-karboksamidin altı eşlenik ve DIPEA altı eşlenik reçine üzerinde serbest amin başına kullanılır (yani, her biri N'dir Arg tipi monomer altı eşlenik yüklenecek). Yine, bu reaksiyon, aynı zamanda verimli ve pirazol-1-karboksamidin reaktifi DMF içinde iyi bir çözünürlüğe sahiptir. Reaksiyonun tamamlanması tipik olarak oda sıcaklığında 60 dakika sonra LC-MS ile görülmektedir.

submonomer yönteminin çok yönlülüğü, birincil aminlerin çok çeşitli değiştirme aşamasında kullanılabilir şartlarına bağlı olarak birleştirme ka artırmak için optimize edilmesi gerekebilir, böyleceYukarıda tartışılan dizilerin için Verimliliği ve genel ürün verimleri veya saflık. 31, özel koşullar başarılı kaplinler için gerekli idi. Ancak, daha uzun değiştirme süreleri veya daha yüksek bir amin konsantrasyonları sorunlu yer değiştirme (örneğin, kötü nükleofilik veya sterik açıdan hacimli aminler için) için kullanılabilir. Bazı aminler durumda yerine submonomer sentezi için daha önce kapsamlı bir yöntemde olduğu gibi N-metil-2-pirolidon (NMP) ya da katı faz reaksiyonları için diğer uygun çözücüler içinde, bu erimesi tavsiye edilir, DMF içinde tamamen çözünebilir olabilir peptoidler arasında. 32 kloroasetik asit kullanılarak asetilasyon, diğer gruplar tarafından etkili olduğu gösterilmiştir, yan zincirler korumasız heteroatom ihtiva monomerler dahil etmek. 33. Buna ek olarak, diğer reçineler farklı C terminali işlevsellik ile peptoidler elde etmek için bu yöntemle kullanılabilir. Wang reçine ve 2-klorotritil klorür reçineleri rutin olarak kullanılanpeptoidler bir submonomer sentezi. Örneğin, bu yöntem, başarılı bir şekilde Rink Amide burada (kullanılan spesifik reçine bağlı olarak) ele 2 farklı katı destekler farklı yükleme prosedürü gerektirir. Grubumuz 2-klorotritil klorür reçinesi ile kullanılan bu nedenle bu literatür kontrol edilmelidir sentezi önce.

Peptid sentezine benzer şekilde, peptoid dışı reçine son bölünme şartları, söz konusu dizi için optimize edilebilir. Bu protokol, bir TFA yarılma kokteyli (tutucular olarak triizopropilsilan ve su ile) kullanılmıştır. Burada yer alan peptoidler makul asit labil gruptur, sadece Boc koruma ihtiva etmiştir. Daha klivaj süreleri gerekebilir, korunan kalıntılar ya da kararsız koruma grupları daha asidin daha yüksek oranda dizilerin tam deproteksiyon sağlamak için (yani, 2 saatten fazla parçalanma süreleri PBF veya üçüncül-met içeren diziler için önerilmektedirasetil ester korumalı gruplar). (Örneğin, etanditiol ya da 2-merkaptoetanol, genellikle sistein ya da metionin gibi bir sülfür ihtiva eden yan zincirlere sahip peptidler kullanılır için) alternatif temizleyiciler, aynı zamanda özel bir yan zincirleri için de kullanılabilir.

sunulan biyolojik deney farklı hücre hatları göre değiştirilebilen bir standart sitotoksiklik testidir. Her 96 oyuklu plaka elde edilen sonuçlar güven sağlamak için yeterli kontroller olması gerektiğini not etmek önemlidir. Bu hastalığın tedavisinde kullanılan bilinen bir ilaçtır Bu durumda, amfoterisin B, bir pozitif kontrol olarak kullanılır ve bu deneme için bir bileşik stok yapmak için kullanılan çözücü olarak DMSO, negatif kontrol olarak kullanılır. Diğer hücre hatları kullanılıyorsa, alternatif, uygun kontroller sağlanmış ve kullanmadan önce valide edilmelidir. L. mexicana bir saat süre ile 100 ve 2 uM arasındaki konsantrasyonlarda peptoid ile inkübe edilir ve daha sonra, parazit / Peptoid çözeltisi ile seyreltilir(yani, kuyular başlangıçta 100 uM Peptoid stoku 10 mcM seyreltilir) gecelik inkübasyon için on bir faktör.

hücre canlılığı, reaktif deneyinin sonunda her oyuk (toplam oyuk hacmi% 10) ilave edilir. Bir görünür renk değişikliği Resim sürdürebilen parazitlerin (mavi) ve canlı parazit ara numaraları ile arasında bir spektrum sürdürebilen parazitlerin (pembe), kontrol kuyuları olan kuyular arasında görülür. Floresan canlı hücre sayısı ile orantılıdır ve hücrelerin metabolik aktivitesine karşılık gelir; resazurin boyası (floresan olmayan), metabolik olarak aktif hücrelerin azalma reaksiyonlarla parlak resorufine dönüştürülür. 34 Bu testte, hücre canlılığı, bir reaktif ile inkübasyon süresi L. için optimize edilmiştir mexicana. levhalar için değişir canlılığı maddesi ile inkübasyon süreleri farklı hücre konsantrasyonlarında da bu yöntem de kullanılabilir, örneğin, farklı hücre hatları (ile tohumlandı) Memeli hücreleri ile. kullanılan tam plaka okuyucu bağlı olarak, düşünceler floresan ölçümleri alınmadan önce yapılması gerekmektedir. kuyularda herhangi bir hava kabarcıkları doğru okumaları alınabilir sağlamak için kaldırılmalıdır. Bazı levha okuyucular durumda düz kullanılmalıdır 96 gözlü levhalar tabanlı olan plakaların alt okuma. Diğer makineler plaka üstüne okuyabilir, bu nedenle plakanın kapak ölçümünden önce çıkarılmalıdır.

Son olarak, gelecekte, bu protokol paralel olarak birçok dizileri yapabilen otomatik synthesizer ile uyumlu olmayabilir. Ek olarak, siklik peptoidler sentezi, bu yöntem kullanılarak da mümkündür. Bu protokol, malzeme ya da tıbbi alanlar dahil olmak üzere birçok uygulamada yararlı olabilir lizin ve arginin-monomerleri, hem yeni bir Peptoid iskeleleri ulaşmak için kullanılabilecek bir bir sentetik prosedür araştırmacılar sağlamalıdır.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Finansal destek için Mühendislik ve Fizik Bilimleri Araştırma Konseyi (EPSRC) (HLB) teşekkür ederim. Biz de bu prosedürün çekimleri sırasında ona yardım için Sridevi Maalika Ramanoudjame teşekkür ederim.

Materials

Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits Crawford Scientific 12131017 and 12131015 20 mL and 6 mL cartridges used in this preparation
Trifluoroacetic acid Tokyo Chemical Industry (Europe) T0431-100g >98%; CAUTION can cause severe burns and respiratory irritation
N-N'-diisopropylcarbodiimide Sigma Aldrich 38370-100ML >98%; CAUTION hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation
Dimethylformamide Fischer Scientific 10346180 HPLC grade; CAUTION suspected teratogen
Acetonitrile Fischer Scientific 10407440 HPLC grade
Dichloromethane Fischer Scientific 10354263 99.8%; CAUTION suspected carcinogen
Bromacetic acid Sigma Aldrich 17000-100G >99%; ; CAUTION causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract
(S)-(-)-alpha methylbenzylamine Sigma Aldrich 115568-100G 98%; CAUTION harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer
N-Boc 1,4 diaminobutane Tokyo Chemical Industry (Europe) A1373-25g >98%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer
N-Boc 1,2 diaminoethane Tokyo Chemical Industry (Europe) A1371-25g >97%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer
1,2 diaminobutane Sigma Aldrich D13208-100G 99%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer
1,4 diaminoethane Sigma Aldrich 03550-250ML >99.5%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer
1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl Sigma Aldrich 402516-10G as HCl salt; CAUTION harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage
Hydrazine monohydrate Sigma Aldrich 207942-5G reagent grade; CAUTION suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes
2-acetyl dimedone Novabiochem 8510150005 Dde-OH
Rink Amide resin Novabiochem 8551190005 100-200 mesh, high loading 
Piperidine Sigma Aldrich 411027-1L >99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781-50G 98%; CAUTION flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation
alamarBlue ThermoFischer  DAL1025 Not classified as hazardous
Schneider's Insect Medium Sigma Aldrich S9895-1L Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays
96 well plates VWR 734-1793 Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated
Solvent reservoirs VWR 613-1182 Used with multi channel pipette
Multi channel pipette Eppendorf 3122000043
Pipette tips Starlab Group S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810 Volume of tip dependent on pipette used. 10 µL, 10 – 200 µL and 1000 µL recommended for assays
25 cm3 cell culture flasks VWR 734-2312
50 mL centrifuge tubes VWR 525-0791
dimethylsulphoxide (molecular biology grade) Sigma Aldrich D8418-50ML Not classified as hazardous
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum ThermoFischer  10082139-100mL Gibco
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer  15140148-20mL Abbreviation: P/S
Amphotericin B Sigma Aldrich 46006-100mg Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids oligo(N-substituted glycines) by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647 (1992).
  2. Bolt, H. L., Cobb, S. L. A practical method for the synthesis of peptoids containing both lysine-type and arginine-type monomers. Org. Biomol. Chem. 14, 1211-1215 (2016).
  3. Mojsoska, B., Zuckermann, R. N., Jenssen, H. Structure-activity relationship study of novel peptoids that mimic the structure of antimicrobial peptides. Antimicrob Agents Chemother. , (2015).
  4. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2794-2799 (2008).
  5. Eggimann, G. A., Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. Investigating the Anti-leishmanial Effects of Linear Peptoids. Chem Med Chem. 10, 233-237 (2015).
  6. Kapoor, R., et al. Antimicrobial Peptoids Are Effective against Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3054-3057 (2011).
  7. Ryge, T. S., Frimodt-Moller, N., Hansen, P. R. Antimicrobial activities of twenty lysine-peptoid hybrids against clinically relevant bacteria and fungi. Chemotherapy. 54, 152-156 (2008).
  8. Huang, M. L., Benson, M. A., Shin, S. B. Y., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. Amphiphilic Cyclic Peptoids That Exhibit Antimicrobial Activity by Disrupting Staphylococcus aureus Membranes. Eur. J. Org. Chem. , 3560-3566 (2013).
  9. Huang, M. L., Shin, S. B. Y., Benson, M. A., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. A Comparison of Linear and Cyclic Peptoid Oligomers as Potent Antimicrobial Agents. Chem Med Chem. 7, 114-122 (2012).
  10. Bolt, H. L., Eggimann, G. A., Denny, P. W., Cobb, S. L. Enlarging the Chemical Space of Anti-leishmanials: a Structure-Activity Relationship Study of Peptoids against Leishmania mexicana, a Causative Agent of Cutaneous Leishmaniasis. Med Chem Comm. , (2016).
  11. Chon, S. Y., et al. Antibiotic overuse and resistance in dermatology. Dermatologic therapy. 25, 55-69 (2012).
  12. Alvar, J., et al. Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. PLOS ONE. 7, (2012).
  13. Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends Parasitol. 21, 508-512 (2005).
  14. Kedzierski, L. Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today?. J Global Infect Dis. 2, 177-185 (2010).
  15. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clin Microbiol Rev. 19, 111-126 (2006).
  16. Huang, W., et al. Learning from Host-Defense Peptides: Cationic, Amphipathic Peptoids with Potent Anticancer Activity. PLOS ONE. 9, (2014).
  17. Wender, P. A., et al. The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13003-13008 (2000).
  18. Schröder, T., et al. Peptoidic Amino- and Guanidinium-Carrier Systems: Targeted Drug Delivery into the Cell Cytosol or the Nucleus. J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).
  19. Kömel, D. K., et al. Cell-penetrating peptoids: Introduction of novel cationic side chains. Eur. J. Med. Chem. 79, 231-243 (2014).
  20. Hein-Kristensen, L., Knapp, K. M., Franzyk, H., Gram, L. Bacterial membrane activity of α-peptide/β-peptoid chimeras: Influence of amino acid composition and chain length on the activity against different bacterial strains. BMC Microbiology. 11, 1-12 (2011).
  21. Su, Y., Doherty, T., Waring, A. J., Ruchala, P., Hong, M. Roles of Arginine and Lysine Residues in the Translocation of a Cell-Penetrating Peptide from (13)C, (31)P and (19)F Solid-State NMR. Biochem. 48, 4587-4595 (2009).
  22. Andreev, K., et al. Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes. BBA Biomembranes. 1838, 2492-2502 (2014).
  23. Foged, C., et al. Cellular uptake and membrane-destabilising properties of alpha-peptide/beta-peptoid chimeras: lessons for the design of new cell-penetrating peptides. BBA Biomembranes. 1778, 2487-2495 (2008).
  24. Vedel, L., et al. Antiplasmodial and prehemolytic activities of alpha-peptide-beta-peptoid chimeras. Chem Bio Chem. 8, 1781-1784 (2007).
  25. Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. J Computer-Aided Mol Des. , 1-7 (2016).
  26. Bates, P. A. Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture. Parasitol. 108, 1-9 (1994).
  27. Gossage, S. M., Rogers, M. E., Bates, P. A. Two separate growth phases during the development of Leishmania in sand flies: implications for understanding the life cycle. Int J Parasitology. 33, 1027-1034 (2003).
  28. Seo, J., Lee, B. C., Zuckermann, R. N., Ducheyne, P. . Comp Biomaterials. 2, 53-76 (2011).
  29. Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde – A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Lett. 37, 2625-2628 (1996).
  30. Culf, A. S., Ouellette, R. J. Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (alpha-peptoids) and derivatives. Molecules. 15, 5282-5335 (2010).
  31. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets. J Vis Exp. , e3373 (2011).
  32. Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis. J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).
  33. Nakayama, G. R., Caton, M. C., Nova, M. P., Parandoosh, Z. Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro. J Immunol Methods. 204, 205-208 (1997).

Tags

PeptoidsLysineArginineAnti-leishmanial ActivityCutaneous LeishmaniasisLeishmania MexicanaSubmonomer SynthesisFmoc-protected ResinPiperidineBromoacetic AcidDICAmine Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J. Vis. Exp. (117), e54750, doi:10.3791/54750 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image