A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.
This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized ‘lysine’ and guanido functionalized ‘arginine’ peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.
Peptóides (ou poli- N-substituído glycines) são uma classe de miméticos de péptidos-que oferecem propriedades semelhantes a péptidos e, como tal, estão cada vez mais a ser investigados para aplicações medicinais e materiais. Em péptidos, a cadeia lateral de cada aminoácido está ligado ao α-carbono da espinha dorsal de amida; em pept�des as cadeias laterais são deslocados para o átomo de azoto do esqueleto. Fundamentalmente, isto dá pept�des maior resistência à proteólise.
Peptóides são normalmente sintetizados utilizando o método submon�ero iniciada por Zuckermann et al., Onde monómeros pept�des pode ser construído por haloacetylation sequencial de uma funcionalidade amina ligado a um suporte sólido e subsequente deslocamento do halogéneo com uma amina primária. 1 O nosso grupo desenvolveu recentemente uma adaptação deste método para permitir submon�ero lisina- e do tipo arginina resíduos pept�des para ser incluído dentro da mesma sequência para o f peptóideirst tempo. 2 Esta abordagem manual em fase sólida para a síntese de pept�des utiliza reagentes comercialmente disponíveis e equipamentos de laboratório comum, tornando-o acessível para a maioria dos laboratórios. Peptóides ter sido demonstrado ter actividade promissora contra uma vasta gama de bactérias Gram-negativas, as espécies bacterianas e fúngicas Gram-positivas que são comparáveis aos diversos péptidos antimicrobianos conhecidos. 09/03
Em nosso trabalho, peptoids têm sido usados como compostos anti-infecciosos inovadoras para o tratamento da leishmaniose doença tropical negligenciada. 5,10 leishmaniose é endêmica em mais de 80 países em todo o mundo e estima-se que mais de 12 milhões de pessoas estão infectadas em todo o mundo. 11 A doença é causada por parasitas protozoários que são transmitidos pela picada de um mosquito pólvora. espécie de Leishmania pode causar leishmaniose cutânea, uma condição que conduz à formação de cicatrizes e a lesão das membranas mucosas, ou a leis visceral com risco de vidahmaniasis, o que provoca danos em órgãos fatal. Nenhuma vacina está actualmente disponível para esta doença e os tratamentos actuais dependem de um pequeno número de fármacos que têm efeitos secundários graves. Além disso, a resistência a fármacos existentes é um problema emergente e grave assim novos tratamentos são desesperadamente necessário para tratar eficazmente a leishmaniose no futuro 12-16.
Nestas aplicações antimicrobianas, peptóides são frequentemente concebidos para serem anfipático com uma mistura de monómeros hidrófobos e catiónico. Isto pode dar 3,4 pept�des um grau de selectividade em relação a células bacterianas, reduzir a toxicidade para as células de mamíferos, e para melhorar a sua actividade como transportadores moleculares . 17-20 a maioria dos pept�des anti-infecciosos na literatura contêm cadeias laterais catiónicas que são exclusivamente constituídas por qualquer amino funcionalizado monómeros do tipo lisina ou resíduos de tipo arginina. quimeras péptido-pept�des, onde as cadeias catiónicos são compostos de um amino ácidos lisina ou arginina, também foram sintetizados para analisar o efeito de grupos catiónicos sobre a actividade e a toxicidade 21-25.
pept�des poli-lisina podem ser facilmente sintetizados utilizando aminas protegidas com Boc comercialmente disponíveis. Os peptóides poli-arginina relatado pode ser feita utilizando um método que utiliza pirazole-1-carboxamidina como um agente guanidinylation. 18 No entanto, isso só pode ser realizada após a peptóide foi clivado a partir da resina e a protecção Boc na cadeia lateral removida, assim cada resíduo de tipo lisina dentro da sequência é transformada em um resíduo de arginina. Num esforço para aperfeiçoar as propriedades químicas e biológicas dos compostos, foi desenvolvido um método que permite a dupla funcionalidade catiónica (por exemplo, N e N Lys Arg) para ser incluído em qualquer dada sequência peptóide pela primeira vez 2.
Aqui, nós descrevemos a síntese, purificação e caracterização de TWo romance peptoids que contêm ambos os resíduos lisina- e do tipo arginina na mesma sequência. O método utiliza ortogonal protecção N-Boc e N -Dde em resina com pirazole-1-carboxamidina como um reagente guanidinylation. A avaliação biológica destas pept�des também é descrito em ensaios de citotoxicidade contra Leishmania mexicana, o agente causador da leishmaniose cutânea. Isto fornece um método prático para acessar peptoids com a funcionalidade catiônica dupla e para avaliar sua atividade biológica. Espera-se que este método vai ajudar a síntese de peptóides anfipáticos pela comunidade peptóide no futuro.
Peptóides estão cada vez mais a ser estudados na biologia química e campos de química medicinal em aplicações tais como novas terapias 3-5, agentes de entrega de células 18,20 e ferramentas de diagnóstico. 29 Tipicamente, estas sequências são catiónico para proporcionar um grau de selectividade para o agente patogénico sobre células de mamíferos, a capacidade de penetrar através das membranas celulares e também ajudar a solubilidade em sistemas aquosos. Existem inúmeros exemplos de peptoids catiônicos que contêm resíduos exclusivamente lisina- ou arginina-mimética na literatura. No entanto, até à data, a síntese de peptóides que contêm ambos estes resíduos catiónicos na mesma sequência tem sido dificultada pela falta de um processo de síntese adequado. O protocolo aqui descrito permite pept�des catiónicos mistos a ser sintetizado de uma maneira eficiente e é altamente desejável, uma vez que oferece uma via para modular as propriedades biológicas e químicas do pept�des anfipáticos.
nt "> O nosso método utiliza uma adaptação à síntese peptóide submon�ero comumente utilizados e permite a adição de ambos os monómeros de lisina- e do tipo arginina dentro da mesma sequência. Ela usa acoplamentos temperatura ambiente e estabeleceu protector da química do grupo assim prevê-se que este método irá ser útil para a maioria dos grupos de pesquisa. para adicionar protecção ortogonal para o resíduo de tipo arginina, uma diamina não protegida é adicionada sob condições padrão de deslocamento e, em seguida, protegida num acoplamento de 60 minutos com Dde-OH. uma variedade de diaminas podem ser utilizada que permite que as cadeias laterais de dois carbonos a 6 carbonos de comprimento ser instalado, ou seja, 1,2-diaminoetano, a 1,6-diamino-hexano respectivamente. a protecção Dde-OH dissolve bem em DMF e é um grupo de protecção muito eficaz e selectivo para aminas primárias. o grupo de protecção Dde-aminas secundárias folhas inalteradas, por exemplo, o terminal N desprotegido da cadeia peptóide. 30 Uma limitação é que todo o syntese foi realizada manualmente; No entanto, antecipa-se que as condições de acoplamento desenvolvido tornar o método favorável para uso com o péptido / sintetizadores automatizados pept�des.A resina na desprotecção dos grupos Dde é realizado utilizando-se uma solução de hidrazina a 2% em DMF para deixar aminas livres que podem ser guanidinylated na resina utilizando pirazole-1-carboxamidina. Seis equivalentes do pirazole-1-carboxamidina e seis equivalentes de DIPEA são utilizados por amina livre na resina (isto é, seis equivalentes de cada tipo de monómero N Arg a ser instalada). Mais uma vez, esta reacção também é eficiente e o reagente de pirazole-1-carboxamidina tem boa solubilidade em DMF. A conclusão da reacção é normalmente visto através de LC-MS depois de 60 minutos à temperatura ambiente.
Devido à versatilidade do método do submon�ero, uma ampla variedade de aminas primárias pode ser utilizado no passo de deslocamento de modo que as condições podem necessitar de ser optimizado para aumentar a efi acoplamentoeficiência e rendimentos globais de produtos ou pureza. 31 Para as sequências discutidas acima, há condições especiais eram necessárias para acoplamentos bem sucedidos. No entanto, tempos mais longos de deslocamento ou concentrações mais elevadas de amina pode ser utilizado para deslocamentos problemáticos (isto é, para aminas estericamente volumosos nucleofílicos ou mal). Algumas aminas podem não ser completamente solúveis em DMF, caso em que é recomendado para os dissolver em N-metil-2-pirrolidona (NMP), ou outros solventes adequados para as reacções em fase sólida, em vez de em um método para a síntese anterior abrangente submon�ero de peptóides. 32 para incorporar monómeros que contêm heteroátomos não protegidos nas cadeias laterais, acetilação utilizando ácido cloroacético tem sido mostrado para ser eficaz por outros grupos. 33 Adicionalmente, outras resinas podem ser utilizadas com este método para se obter pept�des com diferentes funcionalização do terminal C. Wang resinas e resinas de cloreto de 2-clorotritilo são rotineiramente utilizados nasubmon�ero síntese de peptóides. Por exemplo, este método tem sido usado com sucesso com resina de cloreto de 2-clorotritilo no nosso grupo. 2 diferentes suportes sólidos irá exigir um procedimento de carga diferente de Rink amida discutidos aqui (dependente da resina específica utilizada) de modo que este deve ser verificado com a literatura antes da síntese.
Semelhante a síntese de péptidos, as condições para a clivagem final da resina peptóide fora também pode ser optimizado para a sequência específica. Neste protocolo, um cocktail de clivagem TFA foi utilizado (com triisopropilsilano e água como catadores). Os peptoids aqui apresentados continha apenas protecção Boc que é um grupo lábil razoavelmente ácido. Para assegurar a desprotecção completa das sequências com uma maior proporção de resíduos de ácido protegido ou menos grupos de protecção lábil, os tempos de clivagem mais longos podem ser necessários (isto é, os tempos de clivagem em excesso de 2 horas são recomendados para sequências que contêm Pbf ou terc-buéster Tyl grupos protegidos). sequestrantes alternativos também podem ser usados para as cadeias laterais especializadas (por exemplo, de etanoditiol ou de 2-mercaptoetanol são muitas vezes utilizados em péptidos que têm cadeias laterais contendo enxofre tais como a cisteína ou metionina).
O ensaio biológico é apresentado um ensaio de citotoxicidade padrão que pode ser alterado para se adequar a diferentes linhas celulares. É importante notar que cada placa de 96 poços deverão conter controlos suficientes para permitir que a confiança nos resultados obtidos. Neste caso, a anfotericina B é utilizado como um controlo positivo, uma vez que é uma droga conhecida utilizada para tratar a doença e DMSO é usado como um controlo negativo como este é o solvente usado para fazer reservas de composto para o ensaio. Se outras linhas de células estão a ser utilizados, os controlos adequados, alternativos deve ser obtida e validada antes da utilização. L. Mexicana é incubada com o peptóide a concentrações entre 100 e 2 ^ M, durante uma hora, e, em seguida, a solução parasita / peptóide é diluída pelaum factor de dez para incubação durante a noite (isto é, os poços inicialmente com 100 uM da peptóide são diluídos para 10 | iM).
O reagente de viabilidade de células são adicionados a cada poço (10% do volume total do bem) no final do ensaio. Uma mudança de cor visível é visto entre poços com parasitas viáveis (rosa), os poços de controlo sem parasitas viáveis (azul) e um espectro entre com os números intermédios de parasitas viáveis. A fluorescência é proporcional ao número de células vivas e corresponde à actividade metabólica das células; resazurina corante (não fluorescente) é convertido para o fluorescente resorufina por meio de reacções de redução nas células metabolicamente activas. 34 Neste ensaio, o tempo de incubação com o reagente de viabilidade celular foi optimizado para L. mexicana. Os tempos de incubação com o reagente de viabilidade variará para placas semeadas em concentrações de células diferentes ou com diferentes linhas de células (por exemplo, este método também pode ser usadocom células de mamíferos). Dependendo do leitor de placas exacta utilizada, considerações devem ser feitas antes das medições de fluorescência são tomadas. Quaisquer bolhas de ar em cavidades deve ser removida para garantir leituras precisas podem ser tomadas. Alguns leitores de placas de ler a partir do fundo de placas, no qual caso de fundo plano de 96 placas de poços devem ser usados. Outras máquinas podem ler a partir do topo da placa, de modo que a tampa da placa deve ser removida antes da medição.
Finalmente, no futuro, este protocolo pode ser compatível com sintetizadores automatizados que são capazes de fazer muitas sequências em paralelo. Além disso, a síntese de peptóides cíclicos também é possível, utilizando este método. Este protocolo deve fornecer aos pesquisadores um procedimento sintético prático que pode ser usado para acessar novos scaffolds pept�des com ambos os monómeros lisina- e do tipo arginina, que podem ser de uso em muitas aplicações, incluindo materiais ou campos medicinais.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Conselho de Engenharia e Ciências Físicas Research (EPSRC) para apoio financeiro (HLB). Agradecemos também Sridevi Maalika Ramanoudjame por sua assistência durante as filmagens deste procedimento.
Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits | Crawford Scientific | 12131017 and 12131015 | 20 mL and 6 mL cartridges used in this preparation |
Trifluoroacetic acid | Tokyo Chemical Industry (Europe) | T0431-100g | >98%; CAUTION can cause severe burns and respiratory irritation |
N-N'-diisopropylcarbodiimide | Sigma Aldrich | 38370-100ML | >98%; CAUTION hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation |
Dimethylformamide | Fischer Scientific | 10346180 | HPLC grade; CAUTION suspected teratogen |
Acetonitrile | Fischer Scientific | 10407440 | HPLC grade |
Dichloromethane | Fischer Scientific | 10354263 | 99.8%; CAUTION suspected carcinogen |
Bromacetic acid | Sigma Aldrich | 17000-100G | >99%; ; CAUTION causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract |
(S)-(-)-alpha methylbenzylamine | Sigma Aldrich | 115568-100G | 98%; CAUTION harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer |
N-Boc 1,4 diaminobutane | Tokyo Chemical Industry (Europe) | A1373-25g | >98%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer |
N-Boc 1,2 diaminoethane | Tokyo Chemical Industry (Europe) | A1371-25g | >97%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer |
1,2 diaminobutane | Sigma Aldrich | D13208-100G | 99%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer |
1,4 diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550-250ML | >99.5%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer |
1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl | Sigma Aldrich | 402516-10G | as HCl salt; CAUTION harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage |
Hydrazine monohydrate | Sigma Aldrich | 207942-5G | reagent grade; CAUTION suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes |
2-acetyl dimedone | Novabiochem | 8510150005 | Dde-OH |
Rink Amide resin | Novabiochem | 8551190005 | 100-200 mesh, high loading |
Piperidine | Sigma Aldrich | 411027-1L | >99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects |
Triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781-50G | 98%; CAUTION flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation |
alamarBlue | ThermoFischer | DAL1025 | Not classified as hazardous |
Schneider's Insect Medium | Sigma Aldrich | S9895-1L | Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays |
96 well plates | VWR | 734-1793 | Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated |
Solvent reservoirs | VWR | 613-1182 | Used with multi channel pipette |
Multi channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | |
Pipette tips | Starlab Group | S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810 | Volume of tip dependent on pipette used. 10 µL, 10 – 200 µL and 1000 µL recommended for assays |
25 cm3 cell culture flasks | VWR | 734-2312 | |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 525-0791 | |
dimethylsulphoxide (molecular biology grade) | Sigma Aldrich | D8418-50ML | Not classified as hazardous |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | ThermoFischer | 10082139-100mL | Gibco |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer | 15140148-20mL | Abbreviation: P/S |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | 46006-100mg | Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard |