Retrovirale Transduktion von T-Helferzellen als genetischer Ansatz zur Untersuchung Mechanismen der Kontrolle ihrer Differenzierung und Funktion

Alle Maus Arbeit in diesen Protokollen durchgeführt wurde gemäß der Tiere Scientific Verfahrensgesetz, UK unter dem Tier Projektlizenz vorgenommen 70/6965. 1. Retrovirale Produktion Vor dem Verfahren erhalten alle erforderlichen Zulassungen für gentechnisch veränderte Organismen produzieren und die Verwendung von Retroviren in Säugerzellen. Wachstum von HEK 293T – Zellen Wachsen HEK 293T Zellen auf 10 cm-Gewebekulturschalen in HEK 293T-Medium (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 100 Einheiten / ml Penicillin 0,1 mg / ml Streptomycin und 2 mM L-Glutamin) . Für allgemeine Zellpassage, 01.10 Split-Zellen, wenn sie erreichen Zusammenfluß von Medium zu entfernen und Pipettieren der Zellen von der Platte mit frischen HEK 293T Medium. HINWEIS: Die Zellen sollten Einmündung in 2-3 Tagen erreichen. 293T HEK-Zellen befestigen lose auf der Platte so ist Trypsinierung nicht erforderlich. 24 Stunden vor der Transfektion, Split ein confluent Platte von Zellen 1:10 bis 10 cm-Platte (eine Platte pro Transfektion), so dass die nächsten Tag wurden die Zellen sind ~ 50% konfluent. Die Transfektion von Calciumphosphat – Fällungs Etwa 1 h vor der Transfektion entfernen Medium aus Zellen und vorsichtig 9 ml frischer HEK 293T-Medium zu den Zellen zu verhindern von der Platte löst. Bereiten 2x HEPES – gepufferte Saline (2x HBS) und ein frisches 2,5 M CaCl 2 -Lösung , wie in Tabelle 1 beschrieben. Auftauen DNA Aktien. Für den effizientesten Transfektionen verwenden Plasmid Prep Qualität DNA. In einer 6 – ml – Rundboden oder 15 ml konischen Röhrchen 5 ug retroviraler DNA (pMIG) 4, 5 ug Helfervirus DNA (pCL-Eco) 7 und H 2 O auf 420 & mgr; l hinzuzufügen. Hinzuzufügen 80 ul 2,5 M CaCl 2 um das Endvolumen auf 500 ul zu bringen. Anmerkung: Dies zusammen mit dem nächsten Schritt (Zugabe von 2x HBS) auf einer regelmäßigen bench solange allgemeinen ster geschehenile Technik wird verwendet. Langsam 500 ul 2x HBS Tropfen für Tropfen zu der Mischung über DNA während sanft verwirbelt , so dass die Lösung kontinuierlich gemischt und die CaPO 4 fällt in sogar großen Kristallen. Transfer zu einem Kultur Kapuze Gewebe und fügen Sie langsam die CaPO 4 DNA – Gemisch (1 ml) tropfenweise zu den 9 ml Medium Abdeckung der Zellen , während ständig und vorsichtig auf die Platte wirbeln. Erneut vorsichtig sein, nicht Zellen von der Platte zu lösen. Legen Sie die Zellen wieder in den Inkubator. HINWEIS: An diesem Punkt der CaPO 4 Niederschlag wird unter dem Mikroskop wie kleine Kristalle über die Größe der Bakterien leicht sichtbar sein. Diese sind leicht zu sehen, nach 30-60 Minuten, wenn die Kristalle eine Chance gehabt haben, an der Unterseite der Platte zu begleichen. Sammlung von Virus in Kulturüberständen. Am folgenden Tag (überall von 12 bis 24 Stunden nach der Transfektion) entfernen Sie das Medium und füttern die Zellen mit 10 mleinmal von frischem 293T Medium HEK wieder darauf achten, daß die Zellen von der Platte zu entfernen. HINWEIS: Dies schwächt aus Lymphozyten-hemmende Substanzen, die die HEK 293T-Zellen in das Medium während der Transfektion absondern. Am Abend des zweiten Tages (~ 24 Stunden nach der Transfektion) feed-Zellen mit 3,5 ml frischem HEK 293T Medium. Achten Sie darauf, dass die Platte genau Niveau in den Inkubator gelegt wird, so dass eine Seite nicht trocken bleibt. Sammeln Medium ~ 12 Stunden später (bei 4 ° C) und Futtermittel mit 3,5 ml frischem HEK 293T Medium. Wiederholen collection 2 weitere Male in etwa 12 Stunden Intervallen, so dass etwa 10 ml Medium wird gesammelt. Dies ist das Virus Lager. Spinnen alle restlichen HEK 293T-Zellen und Zelltrümmer durch bei 600 g für 5 min zentrifugiert. Alternativ filtern, um ein 0,45 & mgr; m, niedrige Proteinbindung, Spritzenfilter. Shop-Virus bei 4 ° C und für die besten Titer, verwenden Sie innerhalb eines Tages oder zwei, wie der Titer langsam bei 4 ° C abnehmen wird. Nicht frEeze, da dies erheblich den Titer nimmt ab. 2. Isolierung von primären Naïve CD4 + T – Zellen Isolierung von Leukozytenzellen Euthanize Mäuse durch Genickbruch, CO 2 Ersticken oder andere humane Protokoll angemessen auf die Behandlung der Tiere Regeln der Institution. Präparieren frisch getöteten Mäuse und entfernen Milz und Lymphknoten gewünschten 15. Platzieren Sie die Organe in Vertiefungen einer 6-Well-Gewebekulturplatte enthält, R10-Medium (RPMI-Medium mit 10% hitzeinaktiviertem FBS, 100 Einheiten / ml Penicillin, 0,1 mg / ml Streptomycin, 2 mM L-Glutamin und 0,1% β-Mercaptoethanol) . Verwenden Sie eine Zellkultur Haube für die Präparation von Mäusen und alle nachfolgenden Manipulationen Wahrscheinlichkeit einer Kontamination in den Kulturen zu minimieren. HINWEIS: Halten Sie das R10 Medium kalt und führen Sie alle nachgelagerten Reinigungsschritte bei 4 ° C. Legen Sie eine 70 um Zellkultur Sieb in einen 50 ml konischen Röhrchen ca. 5 ml R10-Medium enthält. Verwenden Sie ein Sieb für die Milz und Lymphknoten von bis zu drei Mäusen. mit dem Ende eines 5 ml Spritzenkolben hinzufügen Milz und Lymphknoten zur Zellsieb und mazerieren. Spülen Sie mit 1-2 ml R10-Medium. Übertragen Zellen auf eine 15 ml konischen Röhrchen und bringen das Volumen von bis zu 14 ml mit R10. Zentrifuge bei 600 × g für 5 min bei 4 ° C. Überstand verwerfen, indem Sie sie mit einem sauberen Bewegung Gießen zu verhindern, dass das Zellpellet zu stören. 2 ml kaltem (4 ° C) Lysepuffer für rote Blutkörperchen (Tabelle 1) zu jedem Röhrchen. Sanft für 3,5 min mischen, auf Eis, um die Röhre zu halten. HINWEIS: Der Zeitpunkt der Auflösung der roten Blutkörperchen kritisch ist der Tod von Lymphozyten zu verhindern. Daher müssen die genaue Timing jeder Charge von Red Zelllysepuffer optimiert werden. In ≈12-13 ml R10-Medium. Unmittelbar Zentrifuge und Überstand verwerfen, wie in Schritt 2.1.5. Führen Sie die Waschschritte 2x mehr Witzh R10 mittlerer restliche Erythrozyten-Lyse-Puffer von den Zellen zu entfernen und den Tod von Lymphozyten vermeiden. Zählen von Zellen in einem Hämocytometer 01.20 in Trypanblau Verdünnen der Ausbeute an lebenden Zellen zu bestimmen. Erwarten Sie etwa 8-10 x 10 7 Zellen pro Maus. Isolierung von CD4 + T – Zellen Magnetic Beads Kit CD8 +, CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, MHC – Klasse – II + und Ter-119 + Zellen zu entfernen. Aliquot 8-10 x 10 7 Zellen aus Schritt 2.1.8 pro 15 ml konischen Röhrchen und Zentrifugieren bei 600 xg für 5 min bei 4 ° C. Gießen Sie den Überstand mit einer sauberen Bewegung weg zu verhindern, dass das Zellpellet zu stören. Resuspendieren der Zellen in jedem Röhrchen in 100 ul hitzeinaktiviertem FBS dann aus dem Satz 100 ul der Antikörpermischung hinzuzufügen. Inkubieren für 30 min bei 4 ° C unter vorsichtigem Mischen auf einer Walze. Während die oben genannten Zellen werden inkubiert, bereiten die Perlen. Resuspendieren Perlen in dem Fläschchen durch Vortexen für> 30 sec übertragen dann 1 ml der Perlen pro 8-10 x 10 7 hergestellten Zellen einem 15 ml konischen Röhrchen. 2 ml R10-Medium pro ml Perlen und vorsichtig mischen. Das Röhrchen wird in den Magneten für 1 min dann den Überstand verwerfen. Entfernen Rohr von den Magneten und resuspendieren Kügelchen in 4 ml R10-Medium. Diese Menge an Perlen ist für zwei Runden der Inkubation ausreichend. Waschen der Zellen am Ende der Antikörper-Inkubation (Schritt 2.2.1) durch Zugabe von 10 ml R10-Medium pro Röhrchen. gut mischen Sie vorsichtig mit Verwirbelung der Röhre und Zentrifuge Zellen bei 600 xg für 5 min bei 4 ° C. Gießen Sie den Überstand mit einer sauberen Bewegung weg zu verhindern, dass das Zellpellet zu stören. Die Zellen in 1 ml R10-Medium. 2 ml der gewaschenen Kügelchen aus Schritt 2.2.2.2 (½ der Menge für jedes Rohr hergestellt) zu jedem Röhrchen von Zellen Antikörper behandelt und Inkubation für 30 min bei 4 ° C unter vorsichtigem Mischen auf einem roller. Resuspendieren Zell-Kügelchen-Mischung durch vorsichtiges Pipettieren 5-mal mit einer Pipette einen schmalen Spitzenöffnung enthält. Schaumbildung vermeiden. Das Röhrchen wird in den Perlen Magnet für 2 min dann den Überstand die negativ selektierten Zellen in ein neues Röhrchen enthält. Bewahren Sie diese Zellen, wie sie die CD4 + Bevölkerung. Wiederholen Sie die negative Selektion noch einmal. Spin-Zellen aus Schritt 2.2.5 bei 600 xg für 5 min bei 4 ° C. Gießen Sie den Überstand, wie in Schritt 2.2.3 und Resuspendieren in 1 ml R10-Medium ab. Führen Sie die Schritte 2.2.4 und 2.2.5 wieder. Nach der endgültigen Auswahl magnetischen Kügelchen, die Zellen zählen Ausbeute zu bestimmen (typische Ausbeuten sind 15-20 x 10 6 Zellen pro 10 8 Leukozyten). Isolierung von naiven CD4 + T – Zellen (CD25 – und CD62L hoch) Zelltrennsäulen Verwendung Zentrifuge CD4 + T – Zellen bei 600 xg für 5 min bei 4 ° C und resuspendieren in 150-200 ulR10 Medium pro 10 8 Zellen. In 2 ul Lager biotinyliertem CD25 monoklonalen Antikörper (Klon 7D4). Inkubieren für 30 min bei 4 ° C unter vorsichtigem Mischen auf einer Walze. Waschen Sie die Zellen durch 10 ml der Zellseparationssäule Puffer Addieren (Tabelle 1). Zentrifuge bei 600 × g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich und schätzen das Volumen des Puffers / Zellen verbleiben. Resuspendieren auf ein Endvolumen von etwa 90 & mgr; l pro 10 7 Zellen. In 20 ul Streptavidinkügelchen pro 10 7 Zellen und mischen sich mit sanften Flicks. Inkubieren für 15 min bei 4 ° C. Während Zellen werden inkubiert, bereiten Sie die mittlere Zelltrennung (MS) Spalten für die manuelle Ansatz. Jede MS Spalte behält 10 7 Zellen, und da CD25 + Zellen typischerweise etwa 10% der gesamten CD4 + Zellen darstellen, verwenden Sie 1 Spalte pro 10 8 CD4 + T – Zellen. Hinzufügen 500 ul Zelltrennsäulenpuffer auf die Säuleund lassen Sie durchfließen. Wiederholen Sie 2 weitere Male. Am Ende der Zellen / Perlen-Inkubation, wasche die Zellen durch Zugabe von 10 ml Zelltrennsäulenpuffer und Zentrifugieren bei 600 xg für 5 min bei 4 ° C. Die Zellen in 500 & mgr; l Zellseparationssäule Puffer pro 10 8 Zellen, aber immer noch 500 & mgr; l verwendet werden, wenn es weniger Zellen sind. Bewerben 500 ul Zellen / Perlen-Suspension in die Kolonne und sammeln die Strömung durch. Führen Sie diese über die Säule 1 mehr Zeit und sammeln die Strömung durch erneut. Spülen der Säule 3-mal mit 500 ul Zelltrennsäulenpuffer, die jeweils von diesen Spülungen zu den gesammelten Zellen durch Zugabe fließen. Dies sind die CD25 – -Zellen. Zählen von Zellen zu bestimmen Ausbeute. Wenn Tregs (CD25 + Zellen) gewünscht sind, zu isolieren wie folgt. Entfernen Sie die Säule aus dem Separator und halten Sie ihn über einem offenen Universal-Schlauch kümmert Sterilität aufrecht zu erhalten. Schnell Pipette 500 ul Zelltrennpuffer auf den colUMN und spülen fest die positive Fraktion, den Kolben mit der Säule geliefert werden. Wiederholen Sie den Spülvorgang 2 weitere Male. Übergeben Sie die positive Fraktion über eine neue MS Zelltrennsäule und entsorgen Sie diesen Durchfluss. auszuspülen Fest der positiven Zellen dreimal nach wie vor und Zentrifuge Zellen bei 600 xg für 5 min bei 4 ° C Die Zellen in 1 ml R10-Medium und zählen die Ausbeute zu bestimmen. CD62L hoch T – Zellen, die CD25 Zentrifuge – – T – Zellen isoliert oben in Schritt 2.3.6 bei 600 xg für 5 min bei 4 ° und resuspendieren in 150-200 ul R10 Medium pro 10 7 Zellen CD25 zu erhalten. In 5 ul Lager biotinyliert CD62L monoklonalen Antikörper (Klon MEL-14) und Inkubation für 30 min bei 4 ° C unter leichtem Rühren auf einer Rolle wie zuvor. Führen Sie waschen, Streptavidin Auffädeln Bindung und Zelltrennsäule Vorbereitung für Treg Isolierungsprotokoll beschrieben (2.3.7). Dieses Mal Gebrauchdie große Zelltrennung (LS) Säule, die eine Kapazität von 10 8 Zellen hat. Da CD62L hoch T Zellen typischerweise etwa 60-70% der CD25 darstellen – Zellen, verwenden Sie 1 LS Zellseparationssäule pro 10 8 Zellen. In Zellen / Perlen-Mischung zu LS Zelltrennsäule als 2.3.6 in Schritt beschrieben – diesmal die endgültige Strömungs Verwerfen durch und Spalte Spülungen. Sammeln Sie die CD62L hoch T – Zellen , wie in Schritt 2.3.7 für die CD25 + Zellsammlung beschrieben. Zentrifugen Zellen bei 600 xg für 5 min bei 4 ° C. Die Zellen in 1 ml R10 und zählen Ausbeute zu bestimmen. Die Lösung wird bis 0.75-1 X10 6 Zellen pro ml in R10 Medium. Analysieren Reinheit von Zellen durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). FACS-Färbung Strategie Für Zellen vor und nach alle Stufen der Isolierung, Fleck mit CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (Helfer und zytotoxische T-Zellen) und MHCII-PE (MHC-Klasse-II-exprimierenden Zellen). Für Zellen vor und nach der CD25 Isolation, Fleck mit CD4-FITC und CD25-PE (Tregs im Vergleich zu anderen Helfer-T-Zellen). Für Zellen vor und nach dem CD62L Isolation Fleck mit CD4-FITC, CD62L-PE und CD44-APC (naiv gegenüber Speicher und Effektor-Helfer-T-Zellen). Für jede Analyse Platz 10 5 Zellen in einer Vertiefung einer 96 – Well – U-Bodenplatte. Zentrifuge bei 600 × g für 5 min bei 4 ° C. Gießen Sie das Medium ab und waschen Sie die Zellen einmal mit 200 ul DPBS. Zentrifuge nach oben und abgießen DPBS. Je 50 ul DPBS pro Vertiefung und 0,5 ul jeder Antikörper (wie in 2.4.1 angegeben) und Inkubation bei RT für 30 min im Dunkeln Bleichen von fluoreszierenden Markierung zu vermeiden. Waschen Sie die Zellen 2x mit DPBS wie in 2.4.2 und sofort auf einer Fluss analysieren Protokolle und Richtlinien speziell für das Instrument zur Hand cytometer verwenden. HINWEIS: Nach dem letzten Isolierungsschritt von einer guten Vorbereitung, 90-95% der Zellensein CD4 + CD25 – CD62L hoch T – Zellen. 3. retroviraler Transduktion von aktivierten CD4 + T – Zellen und ihre Differenzierung in spezifische T Helper Subsets Retrovirale Transduktion HINWEIS: Retrovirale Integration und Expression von Genen erfordert Zellteilung. Daher müssen T-Zellen aktiviert O / N sein. Während der Isolierung der naiven T-Zellen, Mantel eine 24-Well-Gewebekulturplatte mit Anti-CD3 und anti-CD28 in DPBS verdünnt Antikörper. In 250 ul pro Vertiefung. Verwenden anti anti-CD3 bei 1 ug / ml. Verwenden anti-CD28 bei 2 & mgr; g / ml, wenn die Zellen schließlich unter Th0, Th1, Th2 und iTregs Bedingungen unterschieden werden. Verwenden Sie Anti-CD28 bei 10 ug / ml für Th9 und Th17 Bedingungen. Inkubiere ~ 2 h bei 37 ° C in einem Gewebekultur-Inkubator. Unmittelbar vor der Kultivierung der Zellen, entfernen Sie die Antikörperlösung und waschen Sie die Platte mit ~ 250 ul DPBS pro Vertiefung unbou entfernennd Antikörper. Seien Sie nicht vorsichtig die Platte so austrocknen zu lassen, maximal 6 Vertiefungen zu einer Zeit verarbeiten. Entfernen DPBS waschen und 1 ml naiven CD4 + T – Zellen in R10 – Medium bei 0,75-1 x 10 6 Zellen pro ml. Zellen aktivieren O / N (14-16 h). Am folgenden Tag Zentrifugen Zellen in der Platte bei 900 xg für 5 min bei 30 ° C-Zellen auf den Boden der Vertiefungen zu befestigen. Sammeln und das Medium speichern darauf achten, daß die Zellen zu verdrängen und ersetzen mit 1 ml Virus Kulturüberstand aus der Virusproduktion Protokoll vorbereitet. nicht austrocknen die Zellen lassen so ein Maximum von 4 Vertiefungen zu einer Zeit verarbeiten. Zu jeder Vertiefung für 1 & mgr; l von 8 mg / ml Polybren und 10 ul 1 M HEPES , pH 7,5 , auf Virusaufnahme und verhindern signifikante Alkalisierung in der Umgebungs CO 2 während der nachfolgenden Zentrifugation unterstützen. Centrifuge Zellen in der Platte bei 900 × g für 90 min bei 30 ° C Differenzierung von Zellen in SpeziFic Subsets Entfernen Sie vorsichtig mit 1 ml des Mediums gesammelt oben in Schritt 3.1.4, das Virus Kulturüberstand und ersetzen, da sie IL-2 und andere T-Zell-Wachstumsfaktoren enthält. Fügen angegebenen Reagenzien in Tabelle 2 und Kulturzellen für 3-4 Tage Zellen in bestimmte Untergruppen zu unterscheiden. Analyse von Zellen Für die intrazelluläre Färbung von Zytokinen, behandeln Zellen mit 1 & mgr; g / ml jeweils von Phorbol-12-Myristat-13-acetat (PMA) und Ionomycin für 4 Stunden. Während der letzten 2 Stunden der Stimulation, fügen Sie 1 & mgr; g / ml Brefeldin A. Die Zellen aus dem Boden jeder Vertiefung durch Auf- und Abpipettieren mehrmals. Übertragen etwa 10 5 Zellen auf einer 96 – Well U Bodenplatte ( in der Regel 100 & mgr; l aus der 1 ml der Kultur von Th – Zellen) zur Fixierung und Färbung. Für GFP-Färbung fixieren Zellen mit 100 & mgr; l von 2% Paraformaldehyd bei RT für genau 5 min, als eine längere Inkubationszeit wird das GFP ein Bleichmittelnd stören Foxp3 Färbung. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 100 ul DPBS in jede Vertiefung und Zentrifuge bei 600 × g bei 22 ° C für 5 min. Gießen Sie den Überstand ab. Achtung: Paraformaldehyd ist giftig. Behandeln Sie ihn in einem Abzug mit der Haut und Augenschutz. Fix die Zellen wieder mit 100 ul 1x Fixation Puffer aus der Foxp3 Färbekit gemacht (1 Volumen Fixation Puffer zu 3 Volumina Verdünnungsmittel). Inkubieren der Zellen für 45 min bei RT oder bei 4 ° C für 16 Stunden inkubieren. Nach der Fixierung Permeabilisierung Zellen durch aus dem gleichen Kit 100 ul Permeabilisierung Puffer hinzuzufügen. für 30-45 Minuten bei RT inkubieren, dann für 5 min bei 600 × g bei 22 ° C zentrifugieren. Für Antikörper-Färbung, Fixierung / Permeabilisierung Puffer und 50 ml frisches Permeabilisierung Puffer zu entfernen. Fügen Sie den erforderlichen Antikörper verdünnt in Permeabilisierung Puffer bei 0,5 & mgr; l pro 50 & mgr; l Puffer pro Probe. Inkubieren für 30-45 min bei RT in Dunkelheit Bleichen von Grippe zu vermeidenorescent Label. Zugabe von 150 & mgr; l Puffer und Permeabilisierung Zentrifuge bei 600 × g bei 22 ° C für 5 min. Entsorgen Sie die Permeabilisierung Puffer und 200 ul DPBS. Analysieren Sie mit einem Durchflusszytometer Protokolle und Richtlinien speziell für das Instrument an der Hand. HINWEIS: Stellen Sie sicher , dass geeignete Kontrollen für Zytokinfärbung wie Färben mit Isotypenkontrolle Antikörper enthalten, nicht aktivierten oder Th0 aktivierten Zellen zu analysieren, usw.