فيروسات تنبيغ من الخلايا التائية المساعدة كنهج الوراثي لدراسة آليات السيطرة على التمايز وظيفة
Summary
وقد استخدمت العديد من النظم التجريبية لفهم الآليات التي تنظم نمو الخلايا T وظيفة في الاستجابة المناعية. هنا يتم وصف نهج الوراثي باستخدام تنبيغ فيروسات، وهو الاقتصادية، والوقت كفاءة، والأهم من ذلك، مفيدة للغاية في تحديد مسارات التنظيمية.
Abstract
Helper T cell development and function must be tightly regulated to induce an appropriate immune response that eliminates specific pathogens yet prevents autoimmunity. Many approaches involving different model organisms have been utilized to understand the mechanisms controlling helper T cell development and function. However, studies using mouse models have proven to be highly informative due to the availability of genetic, cellular, and biochemical systems. One genetic approach in mice used by many labs involves retroviral transduction of primary helper T cells. This is a powerful approach due to its relative ease, making it accessible to almost any laboratory with basic skills in molecular biology and immunology. Therefore, multiple genes in wild type or mutant forms can readily be tested for function in helper T cells to understand their importance and mechanisms of action. We have optimized this approach and describe here the protocols for production of high titer retroviruses, isolation of primary murine helper T cells, and their transduction by retroviruses and differentiation toward the different helper subsets. Finally, the use of this approach is described in uncovering mechanisms utilized by microRNAs (miRNAs) to regulate pathways controlling helper T cell development and function.
Introduction
The immune response must be highly regulated to eliminate infections but prevent attacks on self-tissue that lead to autoimmunity. Helper T cells play an essential role in regulating the immune response, and a great deal of effort has been undertaken to understand their development and function (illustrated in several recent reviews 1-3). However, many questions remain, and many approaches have been utilized to study the mechanisms controlling helper T cell development and function. These have ranged from the use of in vitro cell culture systems to whole animals. Cell culture systems, especially those using cell lines, offer the benefit of ease of use and the ability to generate large amount of material to do sophisticated biochemical analyses. However, they suffer from their limited ability to reproduce the actual conditions occurring in an immune response. In contrast, whole animal experiments offer the benefit of relevance, but they can suffer from difficulties in manipulation and the ability to perform precise controls in addition to their large costs and ethical implications. Nevertheless, the vast majority of helper T cells studies today still require the use of whole animal experiments involving primary T cells because of the inability of cell lines to duplicate the exact steps occurring in the whole animal. Therefore, it is essential to utilize cost effective approaches that are highly informative.
Genetics is one powerful tool to study helper T cell development and function, yet traditional methods involving gene knockouts or transgenes are time consuming and expensive so they are often out of reach of small labs. However, retroviral transduction offers a powerful, rapid and, cost effective genetic approach to study the mechanisms of specific gene products. Therefore, it is commonly used in papers studying helper T cell development and function.
We have optimized a procedure for retroviral transduction of helper T cells. It utilizes the pMIG (Murine stem cell virus-Internal ribosomal entry site-Green fluorescent protein) retroviral expression vector, in which the gene of interest can be cloned and thereby expressed from the retrovirus long terminal repeat (LTR) 4. In addition, downstream of the inserted gene of interest is an internal ribosome entry sequence (IRES) followed by the green fluorescent protein (GFP) gene so transduced cells can easily be followed by their expression of GFP. The vector was originally derived from the Murine Stem Cell Virus (MSCV) vectors, which contain mutations in repressor binding sites in the LTRs making them resistant to silencing and thus, giving high expression in many cell types including helper T cells 5,6. Production of high titer retrovirus requires a simple transient transfection protocol of human embryonic kidney (HEK) 293T cells with the MIG vector and a helper virus vector that expresses the retroviral GAG, Pol, and Env genes. For this the pCL-Eco helper virus vector 7 works well in producing high titer replication incompetent retroviruses.
Here these protocols for retroviral production and transduction of primary murine T cells are described in addition to some of our results using this approach to study miRNA regulation of gene expression controlling helper T cell differentiation. miRNAs are small RNAs of approximately 22 nucleotides in length that post-transcriptionally regulate gene expression by targeting homologous sequences in protein encoding messenger RNAs and suppressing translation and inducing message instability 8,9. miRNAs play critical roles in developmental gene regulation. They are essential in the earliest stages of development, as embryos that cannot produce miRNAs die at a very early stage 10. In addition miRNAs are important later on in the development of many tissues. They are thought to function by fine-tuning the expression of genes required for developmental programs 1. In helper T cells miRNAs play multiple roles and are required for regulatory T cell (Treg) development 11-14. We used retroviral transduction as a means to dissect the mechanisms of miRNA regulation of Treg differentiation 15. Through such studies important individual miRNAs were determined by retroviral-mediated overexpression. Subsequently, relevant genes regulated by these miRNAs were identified in order to understand the molecular pathways regulated by miRNAs in helper T cell differentiation.
Protocol
Representative Results
Discussion
فيروسات overexpression بوساطة الجينات هو وسيلة قوية لتحليل وظيفة في الخلايا التائية المساعدة، وتنميتها وظيفة غالبا ما يحدده مستوى التعبير من المنظمين الرئيسيين. ومع ذلك، لا بد من تفسير حذرا من نتائج لمستويات التعبير أعلى بكثير من تلك الجينات الذاتية يمكن إدخال العديد من القطع الأثرية. ولذلك، ينبغي أن يقترن هذا الأسلوب مع الآخرين للتحقق من مدى أهمية وظيفة. على سبيل المثال، يجب أن تستكمل overexpression من انخفاض التعبير باستخدام الرناوات siRNAs أو تعطيل مورثة إذا كانت متوفرة. مع miRNAs، نحن تستكمل التجارب overexpression مع تلك الحجب باستخدام الفيروسات التي overexpressed ميرنا الاصطناعي استهداف المواقع التي تصرف مثبطات تنافسية، لميرنا 15. ويمكن أيضا أن تستخدم فيروسات خلايا transduced في فحوصات البيوكيميائية التي تنطوي على الحمض النووي الريبي وتحليل البروتين. ومع ذلك، يشكل قيدا رئيسيا من هذه التجارب هو كفاءة الدقة التنبيغulting في يسكنها خليط من الخلايا transduced وuntransduced. ولذلك، فإن هذه المقايسات على الأرجح تتطلب فرز من GFP + السكان. وأخيرا، يجب أن تكون مجتمعة في فحوصات المختبر التمايز مع التجارب في الجسم الحي، وطريقة واحدة يمكن تحقيق ذلك هو من خلال نقل adoptively خلايا تي transduced في الفئران، وبعد التمايز وتأثيرها على الاستجابة المناعية.
واحدة من القيود الرئيسية لهذا النظام هو حجم الجينوم الحمض النووي الريبي التي يمكن تعبئتها في القفيصة فيروسات. في تجربتنا، والحد الأقصى لحجم إدراج لنظام فيروسات MIG أن يعطي إنتاج فيروس الجيد هو 3-3.5 كيلو بايت. وبالتالي، لا يمكن تحليل الجينات أكبر مع هذا النظام، كما أنها تعطي التتر فيروس الفقيرة. ومع ذلك، فإن معظم الجينات هي أصغر من هذا الحجم لذلك هذا النظام مفيد لمجموعة واسعة من الدراسات الجينية.
مع تنبيغ فيروسات، العديد من البدائل في هذه protocoوقد استخدمت ليرة سورية. وقد استخدمت العديد من الباحثين خطوط الخلايا التعبئة والتغليف التي تعبر عن ثبات الجينات فيروسات (على سبيل المثال مرجع 16). ومع ذلك، فقد حصل على أعلى التتر باستخدام خلايا كلوة 293T القياسية مع زملاء ترنسفكأيشن من ناقلات فيروس المساعد PCL للبيئة. عزل المساعد السذاجة خلايا تي ويمكن أيضا أن يتحقق من خلال الفرز الخلية بدلا من المغناطيسي حبة وفصل الخلية بروتوكول العمود، ولكن هذا يتطلب الوصول إلى فارز الخلية، والتكاليف لمرة ونوع وعادة ما تكون أعلى من الكواشف حبة. وأخيرا، هناك اختلافات على شروط تفعيل استخدامها للتمييز الخلايا التائية المساعدة إلى مجموعات فرعية مختلفة. على سبيل المثال، TCR تحفيز خلايا لفترة طويلة جدا قبل التعرض لظروف حمل Treg يمكن أن تحول دون تحريض من 16. هذا يمكن أن يكون مشكلة لأن التعبير فيروسات يتطلب تقسيم الخلايا الناجم عن تحفيز الخلايا. ومع ذلك، فقد وجدنا تحريض Treg كفاءة استخدام هذا البروتوكول مع O / أكتيف Nأوجه قبل تنبيغ فيروسات.
ضمن هذه البروتوكولات، يتطلب التطبيق الناجح عدة عوامل. ارتفاع عيار الاستعدادات الارتجاعي تحتاج ترنسفكأيشن كفاءة من كلوة خلايا 293T الحمض النووي ذات جودة عالية جدا ومستعدة على وجه التحديد 2X HBS مهمة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن كثافة خلية من خلايا كلوة 293T يجب أن يكون حوالي 50٪ في وقت ترنسفكأيشن لتعبير جيد من الحمض النووي transfected يتطلب أن الخلايا تنمو بنشاط، وسوف تحول دون هذا إذا كانت الخلايا متفرق جدا أو كثيفة. يجب أن الخلايا في كثافة الأمثل خلال ترنسفكأيشن تصل إلى نقطة التقاء في مرحلة ما خلال الخطوات جمع الفيروس، ولكنها ستواصل إنتاج مخزونات فيروس ارتفاع عيار كل طريق للوصول الى جمع الماضي. التمايز كفاءة الخلايا التائية المساعدة يتطلب نوعية جيدة خلية ضمان ذلك أن الخلايا المعزولة إلى نقاء موضح في الشكل 1. وبالمثل، فإن نوعية الخلايا تعتمد على الاب الفئرانام التي تم عزلها. لهذه الدراسات، وقد استخدمنا 6-8 الاسبوع C57BL البالغ من العمر / 6 الفئران. يمكن أن الفئران الأكبر سنا لديهم خلايا أقل ساذجة، وقد تختلف سلالات أخرى في المفاضلة الخاصة بهم. على سبيل المثال، الفئران BALB / ج أكثر عرضة لردود TH2 من C57BL / 6 الفئران 17 حتى كما هو مذكور أعلاه، C57BL / 6 خلايا تي يمكن أن يكون صعبا للحث على استجابة Th2. وبالإضافة إلى ذلك، أي من الشروط التمايز قد تختلف قليلا من المختبر إلى المختبر، وتأثير overexpression الجين قد تصبح فقط واضح في ظروف دون المستوى الأمثل لذلك قد تحتاج إلى معاير تركيزات خلوى في ظروف الاستقطاب المختلفة. وأخيرا، يمكن أن آثار هذا الجين overexpressed أو شروط الاستقطاب على تكاثر الخلايا تؤثر على كفاءة تنبيغ من الآثار قياس الجينات في المصالح قد تتطلب تحسين توقيت وتركيز الكواشف الاستقطاب. يجب تحسين كل هذه العوامل تؤدي إلى نتائج مفيدة مع هذا النظام.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC) grant (BB/H018573/1) and a BD Biosciences grant.
Materials
| RPMI | Sigma | R8758 | |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| Penicillin Streptomycin solution | Sigma | P4333 | |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M3148 | |
| DPBS | Sigma | D8537 | |
| MIG vector | Addgene | Plasmid 9094 | |
| pCL-Eco vector | Addgene | Plasmid 12371 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| Magnetic beads mouse CD4 cell kit | Invitrogen (Dynabeads) | 11415D | |
| Streptavidin Beads | Miltenyi Biotech | 130-048-102 | |
| MS cell separation columns | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| LS cell separation columns | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | |
| CD25 Biotenylated MAb | BD Biosciences | 85059 | clone 7D4 |
| CD62L Biotenylated MAb | BD Biosciences | 553149 | clone MEL-14 |
| Polybrene (Hexadimethrine Bromide) | Sigma | 107689 | |
| Anti-CD3 | eBiosciences | 16-0031-85 | clone 145-2C11 |
| Anti-CD28 | eBiosciences | 16-0281-85 | clone 37.51 |
| Anti-IL-4 | BD Biosciences | 559062 | clone 11B11 |
| Anti-IFN-gamma | BD Biosciences | 559065 | clone XMG1.2 |
| Anti-IL-2 | BD Biosciences | 554425 | cloneJES6-5H4 |
| Recombinant IL-12 p70 | eBiosciences | 14-8121 | |
| Recombinant IL-4 | BD Biosciences | 550067 | |
| Recombinant TGF-beta | eBiosciences | 14-8342-62 | |
| Recombinant IL-6 | eBiosciences | 14-8061 | |
| Recombinant IL-2 | eBiosciences | 14-8021 | |
| PMA | Sigma | P8139 | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| Brefeldin A | eBiosciences | 00-4506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 16005 | Paraformaldehyde is toxic so use appropriate caution when handling |
| Foxp3 staining buffer set | eBiosciences | 00-5523 | |
| Anti-CD4 FITC | eBiosciences | 11-0041 | clone GK1.5 |
| Anti-CD8a perCP-cy5.5 | eBiosciences | 45-0081-80 | clone 53-6.7 |
| Anti-MHCII PE | eBiosciences | 12-0920 | clone HIS19 |
| Anti-CD25 PE | eBiosciences | 12-0251-82 | clone PC61.5 |
| Anti-CD62L PE | eBiosciences | 12-0621-82 | clone MEL-14 |
| Anti-CD44 APC | eBiosciences | 17-0441 | clone IM7 |
| Anti-IFN-gamma FITC | eBiosciences | 11-7311-81 | clone XMG1.2 |
| Anti-IL-4 PE | BD Biosciences | 554435 | clone 11B11 |
| Anti-IL-9 PE or APC | eBiosciences/Biolegend | 50-8091-82/514104 | clone RM9A4 |
| Anti-IL-17a PE | BD Biosciences | 559502 | clone TC11-18H10 |
| Anti-Foxp3 APC or PE | eBiosciences | 17-5773-82/12-5773-80 | clone FJK-16s |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P9333 | |
| Na2HPO4-2H2O | Sigma | 71643 | |
| Dextrose/Glucose | Sigma | G7021 | |
| HEPES, free acid | Sigma | H3375 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Disodium EDTA | Sigma | D2900000 | |
| KHCO3 | Sigma | 237205 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 |
References
- Baumjohann, D., Ansel, K. M. MicroRNA-mediated regulation of T helper cell differentiation and plasticity. Nat Rev Immunol. 13 (9), 666-678 (2013).
- Wilson, C. B., Rowell, E., Sekimata, M. Epigenetic control of T-helper-cell differentiation. Nat Rev Immunol. 9 (2), 91-105 (2009).
- Pearce, E. L., Poffenberger, M. C., Chang, C. H., Jones, R. G. Fueling immunity: insights into metabolism and lymphocyte function. Science. 342 (6155), 1242454 (2013).
- Cherry, S. R., Biniszkiewicz, D., Van Parijs, L., Baltimore, D., Jaenisch, R. Retroviral Expression in Embryonic Stem Cells and Hematopoietic Stem Cells. Mol and Cell Biol. 20 (20), 7419-7426 (2000).
- Miller, A. D., Rosman, G. J. Improved retroviral vectors for gene transfer and expression. BioTechniques. 7 (9), 980-990 (1989).
- Grez, M., Akgün, E., Hilberg, F., Ostertag, W. Embryonic stem cell virus, a recombinant murine retrovirus with expression in embryonic stem cells. Proc Nat Acad Sci USA. 87 (23), 9202-9206 (1990).
- Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. The pCL vector system: rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses. J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).
- Filipowicz, W., Bhattacharyya, S. N., Sonenberg, N. Mechanisms of post-transcriptional regulation by microRNAs: are the answers in sight?. Nat Rev Genetics. 9 (2), 102-114 (2008).
- He, L., Hannon, G. J. MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Nat Rev Genetics. 5 (7), 522-531 (2004).
- Bernstein, E., Kim, S. Y., et al. Dicer is essential for mouse development. Nat Genetics. 35 (3), 215-217 (2003).
- Cobb, B. S., Hertweck, A., et al. A role for Dicer in immune regulation. J Exp Med. 203 (11), 2519-2527 (2006).
- Chong, M. M. W., Rasmussen, J. P., Rudensky, A. Y., Rundensky, A. Y., Littman, D. R. The RNAseIII enzyme Drosha is critical in T cells for preventing lethal inflammatory disease. J Exp Med. 205 (9), 2005-2017 (2008).
- Liston, A., Lu, L. F., O’Carroll, D., Tarakhovsky, A., Rudensky, A. Y. Dicer-dependent microRNA pathway safeguards regulatory T cell function. J Exp Med. 205 (9), 1993-2004 (2008).
- Zhou, X., Jeker, L. T., et al. Selective miRNA disruption in T reg cells leads to uncontrolled autoimmunity. J Exp Med. 205 (9), 1983-1991 (2008).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNA-15b/16 Enhances the Induction of Regulatory T Cells by Regulating the Expression of Rictor and mTOR. J Immunol. 195 (12), 5667-5677 (2015).
- Sauer, S., Bruno, L., et al. T cell receptor signaling controls Foxp3 expression via PI3K, Akt, and mTOR. Proc Nat Acad Sci USA. 105 (22), 7797-7802 (2008).
- Yagi, J., Arimura, Y., Takatori, H., Nakajima, H., Iwamoto, I., Uchiyama, T. Genetic background influences Th cell differentiation by controlling the capacity for IL-2-induced IL-4 production by naive CD4+ T cells. Int Immunol. 18 (12), 1681-1690 (2006).
- Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. MicroRNAs regulate T-cell production of interleukin-9 and identify hypoxia-inducible factor-2a as an important regulator of T helper 9 and regulatory T-cell differentiation. Immunology. 149, 74-86 (2016).
