Rétrovirale transduction des cellules T auxiliaires comme une approche génétique pour étudier les mécanismes contrôlant leur différenciation et la fonction

Tous les travaux de la souris effectués dans ces protocoles a été réalisée selon les procédures scientifiques Animaux Loi, Royaume-Uni en vertu de l'animal Licence du projet 70/6965. 1. rétrovirale production Avant de continuer d'obtenir toutes les approbations nécessaires à la production d'organismes génétiquement modifiés et l'utilisation de retrovirus dans les cellules de mammifères. La croissance des cellules HEK 293T Cultiver les cellules HEK 293T sur 10 cm des boîtes de culture tissulaire en milieu HEK 293T (Modified Eagle Medium (DMEM de Dulbecco) avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS), 100 unités / ml Pénicilline 0,1 mg / ml de streptomycine et 2 mM de L-glutamine) . Pour passage cellulaire général, les cellules fractionnées 1:10 quand ils atteignent la confluence en enlevant moyen et pipetage des cellules de la plaque avec un milieu HEK 293T frais. NOTE: Les cellules doivent atteindre la confluence dans 2-3 jours. cellules 293T HEK attachent vaguement à la plaque de sorte trypsinisation est pas nécessaire. 24 heures avant la transfection, diviser un confluePlaque de cellules nt 1:10 à une plaque de 10 cm (une plaque par transfection) de sorte que le lendemain, les cellules sont confluentes à environ 50%. Transfection par Calcium Phosphate Précipitations Environ 1 h avant la transfection, éliminer le milieu des cellules et ajouter soigneusement 9 ml de milieu HEK 293T fraîches pour empêcher les cellules de désolidarisation de la plaque. Préparer 2x Hepes Buffered Saline (2x HBS) et une nouvelle M CaCl2 solution à 2,5 , comme décrit dans le tableau 1. Décongeler les stocks d'ADN. Pour les transfections les plus efficaces d'utiliser l'ADN plasmidique de la qualité de préparation. Dans un 6 ml à fond rond de 15 ml ou tube conique ajoute 5 pg d'ADN rétroviral (pMIG) 4, 5 pg d'ADN de virus Helper (PCL-Eco) 7 et H 2 O à 420 ul. Ajouter 80 ul de 2,5 M de CaCl2 en portant le volume final à 500 ul. Note: Ceci avec l'étape suivante (ajout de 2x HBS) peut être fait sur un banc régulier aussi longtemps que ster généraletechnique ile est utilisé. Ajouter lentement 500 pi de goutte 2x HBS à goutte au mélange d'ADN ci – dessus tout en tourbillonner doucement pour que la solution est mélangée en continu et le capo 4 précipite dans les cristaux même taille. Transférer vers une hotte de culture tissulaire et ajouter lentement le mélange CaPO 4 de l' ADN (1 ml) goutte à goutte à 9 ml de milieu recouvrant les cellules tout en agitant continuellement et doucement la plaque. Encore une fois, veillez à ne pas détacher les cellules de la plaque. Placez les cellules de nouveau dans l'incubateur. NOTE: A ce stade , le capo 4 précipité sera facilement visible sous un microscope sous forme de petits cristaux de la taille des bactéries. Ceux-ci sont facilement visibles après 30-60 min lorsque les cristaux ont eu la chance de se déposer au fond de la plaque. Collection de virus dans les surnageants de culture. Le lendemain (partout 12-24 h après la transfection) éliminer le milieu et nourrir les cellules avec 10 mlde milieu HEK 293T frais une fois de plus en faisant attention à ne pas déloger les cellules de la plaque. NOTE: Cela dilue les substances inhibitrices lymphocytaires que les cellules HEK 293T sécrètent dans le milieu au cours de la transfection. Le soir de la deuxième journée (~ 24 heures après transfection) cellules avec 3,5 ml de milieu HEK 293T frais nourrir. Veillez à ce que la plaque est placée exactement au même niveau dans l'incubateur de sorte qu'un côté ne reste pas sec. Collecter moyen ~ 12 heures plus tard (conserver à 4 ° C) et d'alimentation avec 3,5 ml de milieu HEK 293T frais. Répétez collection 2 plusieurs fois à environ 12 intervalles de h de telle sorte que 10 ml de milieu est recueilli. Ceci est le stock de virus. Spin sur toutes les cellules HEK 293T résiduelles et les débris cellulaires par centrifugation à 600 xg pendant 5 min. Vous pouvez également filtrer en utilisant un filtre à seringue de 0,45 um à faible liaison aux protéines,. virus de magasin à 4 ° C, et pour les meilleurs titres, utiliser dans un jour ou deux, comme le titre diminuera lentement à 4 ° C. Ne frEeze, car cela diminue significativement le titre. 2. Isolement du primaire Naïf cellules T CD4 + Isolement des cellules leucocytaires Euthanasier souris par dislocation cervicale, CO 2 asphyxie, ou un autre protocole humanitaire appropriée aux règles de manipulation des animaux de l'institution. Disséquer souris fraîchement euthanasiés et enlever la rate et de la lymphe souhaitée nœuds 15. Placer les organes dans les puits d'un tissu plaque de culture à 6 puits contenant le milieu R10 (milieu RPMI avec 10% inactivé par la chaleur de FBS, 100 unités / ml de pénicilline, 0,1 mg / ml de streptomycine, 2 mM de L-glutamine et 0,1% de β-mercaptoéthanol) . Utiliser une hotte de culture cellulaire pour la dissection des souris et toutes les manipulations ultérieures pour réduire au minimum risque de contamination dans les cultures. REMARQUE: Conservez le moyen R10 froid et effectuer toutes les étapes de purification en aval à 4 ° C. Placer un 70 um culture cellulaire crépine dans un 50 ml de tube conique contenant environ 5 ml de milieu R10. Utilisez un filtre pour la rate et les ganglions lymphatiques de jusqu'à trois souris. Ajouter les ganglions lymphatiques et la rate au tamis cellulaire et macérer avec l'extrémité d'un piston de la seringue de 5 ml. Rincer avec 1-2 ml de milieu R10. Transfert des cellules dans un tube conique de 15 ml et porter le volume à 14 ml avec R10. Centrifuger à 600 g pendant 5 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant en le versant hors d'un mouvement propre pour éviter de perturber le culot cellulaire. Ajouter 2 ml de froid (4 ° C) , la lyse des globules rouges du tampon (tableau 1) à chaque tube. Mélanger doucement pendant 3,5 min, en gardant le tube sur la glace. NOTE: Le moment de la lyse des globules rouges est essentielle pour prévenir la mort des lymphocytes. Par conséquent, le moment exact de chaque lot de tampon de lyse des globules rouges doit être optimisée. Ajouter ≈12-13 ml de milieu R10. Immédiatement centrifugeuse et éliminer le surnageant comme à l'étape 2.1.5. Effectuez les étapes de lavage 2x plus d'esprith R10 moyen pour éliminer tout résidu de tampon de lyse des globules rouges à partir des cellules et d'éviter la mort des lymphocytes. Compter les cellules dans un hémocytomètre dilution 1:20 en bleu trypan pour déterminer le rendement des cellules viables. Attendez environ 8-10 x 10 7 cellules par souris. Isolement des cellules T CD4 + en utilisant des billes magnétiques Kit pour supprimer CD8 +, CD11b +, CD16 / 32 +, CD45R +, CMH de classe II + et Ter-119 + cellules. Aliquoter 8-10 x 10 7 cellules de l' étape 2.1.8 par 15 ml de tube et centrifuger à 600 xg pendant 5 min à 4 ° C conique. Verser le surnageant avec un mouvement propre pour éviter de perturber le culot cellulaire. Resuspendre les cellules dans chaque tube dans 100 pi de chaleur FBS inactivé puis ajouter 100 ul d'anticorps mélange du kit. Incuber pendant 30 min à 4 ° C avec agitation douce sur un rouleau. Alors que les cellules ci-dessus sont en incubation, préparer les perles. Remettre les billes dans le flacon par tourbillonnement pendant> 30 sec transfèrent ensuite 1 ml de billes par 8-10 x 10 7 cellules préparées à un tube conique de 15 ml. Ajouter 2 ml de milieu R10 par ml de perles et mélanger délicatement. Placer le tube dans l'aimant pendant 1 min, puis jeter le surnageant. Retirer le tube des billes magnétiques et remettre en suspension dans 4 ml de milieu R10. Cette quantité de billes est suffisante pour deux cycles d'incubation. Laver les cellules à la fin de l'incubation de l'anticorps (étape 2.2.1) en ajoutant 10 ml de milieu R10 par tube. Doucement bien mélanger avec tourbillonnant des cellules du tube et centrifuger à 600 xg pendant 5 min à 4 ° C. Verser le surnageant avec un mouvement propre pour éviter de perturber le culot cellulaire. Resuspendre les cellules dans 1 ml de milieu R10. Ajouter 2 ml des perles lavées de l'étape 2.2.2.2 (la moitié de la quantité préparée pour chaque tube) pour chaque tube de cellules traitées avec l'anticorps et on incube pendant 30 min à 4 ° C avec agitation douce sur un transbordeurller. Remettre en suspension le mélange de cellules perles par pipetage 5 fois avec une pipette contenant une ouverture de pointe étroite. Éviter de faire mousser. Placer le tube dans l'aimant de perles pendant 2 min, puis transférer le surnageant contenant les cellules sélectionnées négativement à un nouveau tube. Gardez ces cellules, car ils sont la population CD4 +. Répétez la sélection négative une fois de plus. Spin cellules de l'étape 2.2.5 à 600 xg pendant 5 min à 4 ° C. Décanter le surnageant comme à l'étape 2.2.3 et remettre en suspension dans 1 ml de milieu R10. Suivez les étapes 2.2.4 et 2.2.5 à nouveau. Après la sélection finale de billes magnétiques, compter les cellules pour déterminer la récupération (rendements typiques sont de 15-20 x 10 6 cellules par 10 8 leucocytes). Isolement des cellules T CD4 + Naïf (CD25 – et CD62L haute) l' utilisation des colonnes de séparation de cellules Centrifugeuse cellules T CD4 + à 600 g pendant 5 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 150-200 pi deMoyen R10 par 10 8 cellules. Ajouter 2 ul d'actions biotinylé CD25 anticorps monoclonal (clone 7D4). Incuber pendant 30 min à 4 ° C avec agitation douce sur un rouleau. Laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon de colonne de séparation de cellules (tableau 1). Centrifuger à 600 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirez autant surnageant que possible et estimer le volume de tampon / cellules restantes. Remettre en suspension jusqu'à un volume final d'environ 90 ul pour 10 7 cellules. Ajouter 20 ul de billes de streptavidine par 10 7 cellules et mélanger avec flicks douces. Incuber pendant 15 min à 4 ° C. Alors que les cellules sont en incubation, préparer les colonnes de séparation de milieu cellulaire (MS) pour l'approche manuelle. Chaque colonne MS conserve 10 7 cellules, et depuis les cellules CD25 + représentent généralement environ 10% de CD4 + cellules totale, utilisez 1 colonne par 10 8 cellules T CD4 +. Ajouter 500 pi de tampon de la colonne de séparation de cellules dans la colonneet laisser couler à travers. Répétez 2 fois plus. A la fin de cellule / perle incubation, laver les cellules en ajoutant 10 ml de tampon de la colonne de séparation des cellules et centrifugation à 600 g pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre les cellules dans 500 pi de séparation cellulaire tampon de la colonne par 10 8 cellules, mais toujours utiliser 500 pi s'il y a moins de cellules. Appliquer 500 ul de cellules / billes en suspension dans la colonne et de recueillir le débit à travers. Passez ce sur la colonne 1 plus de temps et de recueillir l'écoulement à travers une fois de plus. Rincer la colonne 3 fois avec 500 pi de tampon de la colonne de séparation des cellules, en ajoutant chaque flux au travers de ces rinçages aux cellules recueillies. Ce sont les CD25 – cellules. Compter les cellules pour déterminer le rendement. Si Tregs (cellules CD25 +) sont souhaitées, isoler de la manière suivante. Retirer la colonne du séparateur et la maintenir au-dessus d'une ouverture universelle tubulaire en prenant soin de maintenir la stérilité. pipette rapidement 500 pi de tampon de séparation des cellules sur le collonne et rincer fermement la fraction positive, en utilisant le piston fourni avec la colonne. Répétez la procédure de rinçage 2 fois plus. Passez la fraction positive sur une colonne de séparation de cellules fraîches MS et jeter ce flux continu. rincer fermement les cellules positives à trois reprises, comme avant et centrifuger les cellules à 600 xg pendant 5 min à 4 ° C les cellules Resuspendre dans 1 ml de milieu R10 et compter pour déterminer le rendement. Pour obtenir CD25 – CD62L cellules haute T, centrifugeuse CD25 – lymphocytes T isolés ci – dessus à l' étape 2.3.6 à 600 xg pendant 5 min à 4 ° et remettre en suspension dans 150-200 ul de milieu R10 par 10 7 cellules. Ajouter 5 pl d'actions biotinylé anticorps monoclonal CD62L (clone MEL-14) et incuber pendant 30 min à 4 ° C en mélangeant doucement sur un rouleau comme avant. Effectuer lavage, Streptavidin perle de liaison, et la préparation de la colonne de séparation des cellules comme décrit pour Treg protocole d'isolement (2.3.7). Cet emploi du tempsla grande colonne de séparation de cellules (LS), qui a une capacité de 10 8 cellules. Puisque les cellules CD62L haute T représentent généralement environ 60-70% de CD25 – cellules, utilisez 1 LS colonne de séparation de cellules par 10 8 cellules. Ajouter le mélange de cellules / bourrelet à LS colonne de séparation cellulaire comme décrit dans l'étape 2.3.6 – cette fois jeter le flux final par le biais et la colonne rinçages. Recueillir les cellules CD62L haute T comme décrit à l' étape 2.3.7 pour la collecte de cellules CD25 +. Centrifuger les cellules à 600 xg pendant 5 min à 4 ° C. Resuspendre cellules dans 1 ml de R10 et comptent pour déterminer le rendement. Diluer à 0,75-1 X10 6 cellules par ml dans un milieu R10. Analyser la pureté des cellules par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Stratégie de coloration FACS Pour les cellules pré et post toutes les étapes d'isolement, tache avec CD4-FITC, CD8a-PerCP-Cy5.5 (helper et T cytotoxiques cellules), et MHCII-PE (CMH de classe II de cellules exprimant). Pour les cellules pré et post isolement de CD25, tache avec CD4-FITC et CD25-PE (Tregs par rapport aux autres cellules T auxiliaires). Pour les cellules pré et post CD62L tache d'isolement avec CD4-FITC, CD62L-PE et CD44-APC (naïve par rapport aux cellules mémoire et effecteur T auxiliaires). Pour chaque lieu d'analyse 10 5 cellules dans un puits d'une plaque à fond en U 96. Centrifuger à 600 g pendant 5 min à 4 ° C. Verser le milieu et laver les cellules une fois avec 200 DPBS ul. Centrifugeuse comme ci-dessus et versez hors DPBS. Ajouter 50 ul de DPBS par puits et 0,5 ul de chaque anticorps (comme indiqué dans 2.4.1) et incuber à température ambiante pendant 30 min dans l'obscurité pour éviter le blanchiment du marqueur fluorescent. Laver les cellules 2x avec DPBS comme dans 2.4.2 et analyser immédiatement un cytomètre de flux en utilisant des protocoles et des directives spécifiques à l'instrument à portée de main. NOTE: Après l'étape d'isolement final d'une bonne préparation, 90-95% des cellules serontêtre CD4 + CD25 – CD62L cellules haute T. 3. rétrovirale transduction des cellules activées T CD4 + et leur différenciation en spécifiques T Helper sous – ensembles rétrovirale transduction NOTE: l'intégration rétrovirale et l'expression des gènes nécessite la division cellulaire. Par conséquent, les cellules T doivent être activées O / N. Bien que l'isolement des cellules T naïves, manteau 24 et le tissu plaque de culture avec des anti-CD28 anticorps dilué dans du DPBS anti-CD3 et. Ajouter 250 ul par puits. Utilisez lutte anti-CD3 à 1 pg / ml. Utilisez anti-CD28 à 2 pg / ml si les cellules seront finalement différenciées sous Th0, Th1, Th2 et iTregs conditions. Utilisez anti-CD28 à 10 pg / ml pour les conditions th9 et Th17. Incuber pendant ~ 2 h à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire. Juste avant la culture des cellules, enlever la solution d'anticorps et laver la plaque avec ~ 250 pi de DPBS par puits pour éliminer unbound anticorps. Veillez à ne pas laisser la plaque sécher afin de traiter un maximum de 6 puits à la fois. Retirer DPBS laver et ajouter 1 ml de cellules CD4 + T naïfs en milieu R10 à 0,75-1 x 10 6 cellules par ml. Activer les cellules O / N (14-16 h). Le jour, le centrifuger les cellules suivantes dans la plaque à 900 g pendant 5 min à -30 ° C à attacher les cellules au fond des puits. Collecter et enregistrer le milieu en faisant attention de ne pas déplacer les cellules, et le remplacer par le surnageant 1 ml de culture de virus préparé à partir du protocole de production de virus. Ne laissez pas les cellules sécher afin de traiter un maximum de 4 puits à la fois. A chaque puits , ajouter 1 pl de 8 mg / ml de polybrène et 10 pi de 1 M de HEPES à pH 7,5 à l' aide de l' absorption du virus et empêcher alcalinisation significatif dans le milieu ambiant du CO 2 lors de la centrifugation suivante. Centrifuger les cellules dans la plaque à 900 g pendant 90 min à 30 ° C Différenciation des cellules dans Specifiques sous-ensembles Retirez délicatement le virus surnageant de culture et le remplacer par 1 ml du milieu recueillies précédemment à l'étape 3.1.4, car il contient de l'IL-2 et d'autres facteurs T de croissance cellulaire. Ajouter les réactifs indiqués dans le tableau 2 et la culture des cellules pendant 3-4 jours pour différencier les cellules en sous-ensembles spécifiques. L' analyse des cellules Pour la coloration intracellulaire des cytokines, traiter les cellules avec 1 pg / ml chacun phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) et l'ionomycine pendant 4 heures. Au cours des 2 dernières heures de stimulation, ajouter 1 pg / ml de brefeldine A. Resuspendre les cellules du fond de chaque puits par pipetage de haut en bas plusieurs fois. Transférer environ 10 5 cellules à une plaque de 96 puits U inférieure (habituellement 100 pi du 1 ml de culture de cellules Th) pour la fixation et la coloration. Pour GFP coloration, fixer les cellules avec 100 pi de paraformaldehyde à 2% à la température ambiante pendant exactement 5 minutes, comme un temps d'incubation plus longue va blanchir la GFP and interférer avec Foxp3 coloration. Laver les cellules en ajoutant 100 ul de DPBS à chaque puits et on centrifuge à 600 g à 22 ° C pendant 5 min. Verser le surnageant. Attention: paraformaldéhyde est toxique. Manipuler dans une hotte avec la peau et une protection oculaire. Fixer les cellules à nouveau à l'aide de 100 pi de tampon 1x fixation fabriqué à partir du kit de coloration Foxp3 (1 volume de tampon de fixation à 3 volumes de diluant). Incuber les cellules pendant 45 min à température ambiante ou encore incuber à 4 ° C pendant 16 heures. Après fixation, les cellules perméabiliser par addition de 100 ul de tampon de perméabilisation de la même kit. Incuber à température ambiante pendant 30-45 min puis centrifuger à 600 g à 22 ° C pendant 5 min. Pour la coloration des anticorps, éliminer le tampon de fixation / perméabilisation et ajouter 50 pi de tampon de perméabilisation frais. Ajouter l'anticorps nécessaire dilué dans du tampon de perméabilisation à 0,5 pi par 50 ul de tampon par échantillon. Incuber pendant 30-45 min à température ambiante dans l'obscurité pour éviter le blanchiment de la grippeétiquette orescent. Ajouter 150 pi de tampon de perméabilisation et centrifuger à 600 g à 22 ° C pendant 5 min. Jeter le tampon de perméabilisation et ajouter 200 DPBS ul. Analyser un cytomètre de flux en utilisant des protocoles et des directives spécifiques à l'instrument à portée de main. REMARQUE: Assurez – vous d'inclure des contrôles appropriés pour cytokine coloration tels que la coloration avec des anticorps de contrôle d'isotype, l' analyse de cellules non activées ou Th0 activées, etc.