La medición paralela de la expresión de genes circadianos del reloj y Hormona en cultivos celulares primarios humanos
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
Los relojes circadianos son funcionales en todos los organismos sensibles a la luz, lo que permite una adaptación al mundo exterior mediante la previsión de los cambios ambientales diarios. considerables progresos en la comprensión de la estrecha conexión entre el reloj circadiano y la mayoría de los aspectos de la fisiología se ha hecho en el campo durante la última década. Sin embargo, desentrañar la base molecular que subyace a la función del oscilador circadiano en los seres humanos se mantiene más alta de desafío técnico. A continuación, ofrecemos una descripción detallada de un enfoque experimental para el largo plazo (2-5 días) de grabación de bioluminiscencia y la recogida de medio de salida en células primarias humanas cultivadas. Para este propósito, hemos transducidas células primarias con un indicador de luciferasa lentiviral que está bajo control de un promotor del gen de reloj del núcleo, lo que permite la evaluación paralela de la secreción de la hormona y la bioluminiscencia circadiano. Además, se describen las condiciones para interrumpir el reloj circadiano en primary células humanas mediante la transfección de siRNA RELOJ de orientación. Nuestros resultados en la regulación circadiana de la secreción de insulina por los islotes pancreáticos humanos, y Myokine secreción de las células del músculo esquelético humanos, se presentan aquí para ilustrar la aplicación de esta metodología. Estos ajustes se pueden utilizar para estudiar la composición molecular de los relojes periféricos humanos y analizar su impacto funcional en las células primarias en condiciones fisiológicas o fisiopatológicas.
Introduction
El sistema de sincronización circadiano (del latín "circa diem") se ha convertido en todos los organismos sensibles a la luz, como un mecanismo de adaptación a la rotación de la Tierra. En los mamíferos, está organizado de una manera jerárquica, que abarca el reloj central, que está situado en el núcleo supraquiasmático del hipotálamo ventral, y periférica (o esclavo) osciladores que son operativos en diferentes órganos. Además, estas células osciladores autónomas autosostenidas son funcionales en casi todas las células del cuerpo 1. Fóticos señales representan una señal de sincronización dominante (Zeitgeber) de las neuronas del SCN, mientras que las señales neurales y humorales que emanan del SCN reajustar los relojes periféricos. Se incrementan los ritmos de descanso-actividad, que impulsan en ciclos de alimentación-ayuno a su vez, son otros sincronizadores para relojes periféricos 2. De acuerdo con nuestro conocimiento actual, la composición molecular del reloj central se basa en la transcripción y translabucles de retroalimentación cionales, que se conservan entre los organismos. Esto comprende los activadores de la transcripción BMAL1 y el reloj, que en conjunto activan la transcripción de los genes negativos de reloj de núcleo PER y llorar. Los altos niveles de PER y proteínas Cry inhibirán su propia transcripción a través de la inhibición del complejo / RELOJ BMAL1. Un bucle auxiliar consta de los receptores nucleares REV-ERB y Rors, que también regulan la transcripción de BMAL1 y el reloj. Por otra parte, los acontecimientos posteriores a la traducción, incluyendo la fosforilación, sumoylation, acetilación, O-GlcNAcylation, la degradación y la entrada en el núcleo de las proteínas del reloj del núcleo representan una capa adicional reguladora importante en el establecimiento del ciclo de oscilación de 24 horas 3.
La acumulación de pruebas se deriva de estudios en modelos de roedores y pone de relieve el papel fundamental del sistema circadiano en la coordinación de las funciones metabólicas y endocrinas 4-5. Un número de large-escala de análisis del transcriptoma indican que la alimentación – ayuno ciclos juegan un papel central en la sincronización de osciladores periféricos 6-8. En un acuerdo con estos estudios, el análisis metabolomic y lipidomic en roedores y seres humanos han revelado que un gran número de metabolitos oscile en el tejido, plasma, saliva y de una manera circadiano 9-11. Es importante destacar que, la mayoría de las hormonas exhiben ritmos circadianos en 5,12-13 sangre. Por otra parte, los relojes circadianos de la correspondiente hormona que produce el tejido periférico podrían regular la secreción de la hormona localmente. Osciladores circadianos células autónomas se han descrito en roedores y células de los islotes pancreáticos humanos 14-16. Estos osciladores juegan un papel esencial en la regulación del transcriptoma de los islotes pancreáticos y la función 15,17-18. Por otra parte, la secreción Myokine por miotubos esqueléticos humanos se ha demostrado recientemente para exhibir un patrón circadiano, que está regulada por oscillato de células autónomasrs operativos en estas células 19.
Varios enfoques para el estudio de los ritmos circadianos en los seres humanos in vivo se han usado ampliamente. Por ejemplo, la melatonina plasma o los niveles de cortisol, así como temperatura de la superficie de la piel torácica (revisado en referencias 3,20) han sido estudiados para evaluar los relojes circadianos endógenos. Aunque estos métodos permiten el estudio de las oscilaciones circadianas sistémicos en vivo, que están lejos de proporcionar una evaluación fiable de los ritmos circadianos autónomos de funcionamiento libre en diferentes órganos y tejidos. Sin embargo, como la disección de la regulación sistémica sería una herramienta indispensable para la comprensión de los efectos específicos de los relojes moleculares intracelulares de la función de estas células. Por lo tanto, se ha realizado un esfuerzo considerable para desarrollar enfoques fiables para el estudio de los relojes humanos en cultivos celulares inmortalizadas o primarios sincronizados in vitro. Es importante destacar que se ha demostrado quecaracterísticas de reloj medidos en células de fibroblastos de piel cultivados primaria reflejan estrechamente las propiedades del reloj individuales de todo el organismo 21. El desarrollo de los reporteros fluorescentes y bioluminiscentes circadianos ha avanzado en gran medida este enfoque 22-27. Por otra parte, el estudio de los relojes de células primarias que se derivan de diferentes órganos periféricos permite la investigación de las propiedades moleculares de los relojes específicos de tejidos humanos 3,5,16,19-20,28. Por lo tanto, la evaluación de los relojes circadianos en in vitro de explantes o células primarias sincronizados, mediante el uso de los reporteros bioluminiscentes, representa un método muy útil para estudiar la composición molecular de los relojes periféricos humanos y su impacto en la función del órgano.
En este artículo, presentaremos los protocolos detallados para la evaluación de la expresión de genes circadianos en las células de los islotes primaria y el músculo esquelético humano sincronizados in vitro, así como el impacto de reloj celular autónomala interrupción de la función secretora de estas células.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los parámetros experimentales descritos aquí se componen de entrega lentiviral de reporteros de bioluminiscencia circadianos en células humanas primarias cultivadas, seguido de la posterior sincronización in vitro y el registro continuo de la bioluminiscencia durante varios días, y el análisis paralelo de la secreción de hormona por las mismas células. Representan un enfoque eficaz para explorar los mecanismos moleculares y los aspectos funcionales de los relojes circadianos en células humanas primaria…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos muy agradecidos a nuestros colegas de la Universidad de Ginebra: Jacques Philippe de comentarios constructivos sobre este trabajo, Ueli Schibler por su inestimable ayuda con el desarrollo del sistema de perfusión y para la inspiración científica, André Liani para el haber concebido el diseño, fabricación y puesta en servicio de el sistema de perfusión, la compañía de Lesa-Technology LTD para la asistencia en el sistema de perfusión y desarrollo de software de goteo biolumicorder, George Severi para obtener ayuda con los experimentos de perfusión, Ursula Loizides-Mangold para la lectura crítica del manuscrito, y Anne-Marie Makhlouf para las preparaciones de lentivirus ; a Etienne Lefai, Stéphanie Chanon y Hubert Vidal (INSERM, Lyon) para la preparación de mioblastos humanos primarios; y para Domenico Bosco y Thierry Berney (Centro de trasplante de islotes humanos, Hospital Universitario de Ginebra) para proporcionar islotes humanos. Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencia de Suiza No. Nacional de Grant 31003A_146475 / 1, el Sinergia Swiss National Science Foundation Grant N º CRSII3-154405, Fondation Romande para la Investigación sobre la Diabetes, en Fundación Bo Hjelt, Fundación Ernst y Lucie Schmidheiny, y Société Académique de Genève (CD).
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
References
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