ヒト初代細胞培養物における概日時計遺伝子発現やホルモン分泌のパラレル測定
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
概日時計は、毎日の環境の変化を先取りすることにより、外部世界への適応を可能にする、すべての光に敏感な生物において機能的です。概日時計と生理学の多くの側面の間の緊密な接続の我々の理解にかなりの進歩は、過去10年間分野で行われています。しかし、ヒトにおける概日振動の機能の根底にある分子基盤を解明することは、最高の技術的な課題のままです。ここでは、培養ヒト初代細胞における長期（2-5日）生物発光記録及び流出媒体のコレクションのための実験的アプローチの詳細な説明を提供します。この目的のために、我々は、ホルモン分泌および概日生物発光の並列評価を可能にするコアクロック遺伝子プロモーターの制御下にあるレンチウイルスルシフェラーゼレポーターで初代細胞を形質導入しています。さらに、我々は広報で体内時計を破壊するための条件を記述するCLOCKを標的とする siRNAをトランスフェクトすることにより、imaryヒト細胞。ヒト骨格筋細胞によるヒト膵島によるインスリン分泌のサーカディアン規制、myokine分泌に対する我々の結果は、この方法論の適用を示すために、ここで提示されています。これらの設定は、ヒト末梢時計の分子構成を研究するために生理学的または病態生理学的条件下での初代細胞に対するそれらの機能的な影響を分析するために使用することができます。
Introduction
（ ラテン語「サーカ日当」から）概日タイミングシステムは、地球の回転に適応機構として、すべての光に敏感な生物で浮上しています。哺乳類では、腹側視床下部の視交叉上核に位置する中央クロックを、包含する、階層的に組織化され、周辺装置（またはスレーブ）異なる器官で動作する発振器。また、これらの細胞自律的な自己持続発振器は本体1のほぼすべての細胞において機能的です。 SCNから発せられる神経および体液性信号が末梢時計をリセットするのに対し、透光層の信号は、SCNニューロンのための支配的な同期キュー（Zeitgeber）を表します。ターン送り絶食サイクルで駆動するほかレスト-活性リズムでは、周辺クロック2のためにさらにシンクロナイザです。私たちの現在の理解によれば、コアクロックの分子メイクアップは、転写およびtranslaに基づいています生物間で保存されている的なフィードバックループ、。これは、一緒に負のコアクロックPERとCRY遺伝子の転写を活性化する転写活性化因子BMAL1とCLOCKを備えます。 PERとCRYタンパク質の高レベルは、BMAL1 / CLOCK複合体の阻害を介して自分の転写を阻害します。補助ループはまた、BMAL1とCLOCKの転写を調節する核内受容体REV-ERBSとRORS、から構成されています。さらに、リン酸化、SUMO化、アセチル化などの翻訳後のイベントは、O-GlcNAc化、劣化及びコアクロックタンパク質の核エントリは、24時間の発振周期3を確立する上で追加の重要な調節層を表します。
蓄積証拠は齧歯類モデルにおける研究から茎および代謝および内分泌機能4-5の連携における概日システムの重要な役割を強調しています。ラーグの数電子スケールのトランスクリプトーム解析給餌することを示唆している-断食サイクルは、周辺の発振器6-8の同期で中心的な役割を果たしています。これらの研究と一致して、げっ歯類およびヒトにおけるメタボロームとlipidomic分析は、代謝物の多くは概日様式9-11に組織、血漿、唾液で発振することを明らかにしました。重要なことは、ほとんどのホルモンは血液5,12-13に概日リズムを示します。また、末梢組織の生産に対応するホルモンの概日時計は、局所的にホルモンの分泌を調節する可能性があります。細胞自律的概日発振器は、げっ歯類とヒトの膵島細胞14-16に記載されています。これらの発振器は、膵島トランスクリプトームと機能15,17-18の調節において重要な役割を果たしています。さらに、ヒト骨格筋管によってmyokine分泌は、最近、細胞自律oscillatoによって調節される概日パターンを示すことが実証されていますこれらの細胞19で動作するRS。
インビボでのヒトにおける概日リズムを研究するためのいくつかの手法が広く用いられています。例えば、プラズマメラトニンまたはコルチゾールレベルだけでなく、（参考文献3,20に見直さ）胸部皮膚表面温度は、内因性の概日時計を評価するために研究されてきました。これらの方法は、in vivoで全身概日振動を勉強できますが、彼らははるかに異なる器官および組織におけるフリーランニング自律概日リズムの信頼性の評価を提供するからです。それにもかかわらず、全身の規制から、このような解剖は、これらの細胞の機能に細胞内の分子時計の具体的な効果を理解するために不可欠なツールとなります。したがって、かなりの努力がin vitroで同期不死化または初代培養細胞でヒトクロックを研究するための信頼性のあるアプローチを開発するために行われています。重要なことはことが実証されています初代培養皮膚線維芽細胞で測定されたクロックの特性は密接に生物全体21の個々のクロック特性を反映しています。蛍光および生物発光概日レポーターの開発が大幅にこのアプローチ22-27を進んでいます。さらに、異なる末梢器官に由来している勉強の初代細胞クロックはヒト組織特異的なクロック3,5,16,19-20,28の分子特性の調査を可能にします。このように、in vitroでの同期の一次外植片または細胞内での概日時計の評価は、生物発光レポーターを使用することにより、分子ヒト末梢時計のメイクや臓器の機能に及ぼす影響を研究するための非常に有用な方法を表しています。
本稿では、自律的な細胞クロックの影響だけでなく、in vitroで同期ヒト初代膵島および骨格筋細胞内の概日遺伝子発現を評価するための詳細なプロトコルを紹介しますこれらの細胞の分泌機能に関する混乱。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明する実験的な設定は、その後のin vitroでの同期や数日間の生物発光の連続記録、および同細胞によるホルモン分泌の平行分析に続いて、培養されたヒト初代細胞への概日生物発光レポーターのレンチウイルスデリバリーで構成されています。彼らは、ヒト初代細胞内で分子機構と概日時計の機能的な側面を探索するための効率的なアプローチを表します。
<p class="jove_conten…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ジュネーブ大学からの私達の同僚に感謝しています：ジャック・フィリップこの作業に関する建設的なコメントのために、Ueli Schibler灌流システムの開発で、科学のインスピレーションのための貴重な助けのための、設計、製造、試運転の考案したためアンドレLianiレンチウイルス調製物のための批判的に原稿を読み取るための灌流実験の支援のために潅流システム、灌流システムとドリップbiolumicorderソフトウェア開発の支援のためのレサ・テクノロジー株式会社の会社、ジョージセベーリ、ウルスラLoizides-マンゴールド、アン・マリーMakhlouf ;エティエンヌLefai、ステファニーChanonヒューバート・ヴィダル（INSERM、リヨン）へのヒト一次筋芽細胞を調製します。そして、ドメニコ・ボスコとティエリー・バーニー（ヒト膵島移植センター、ジュネーブ大学病院）へのヒト膵島を提供します。この作品は、スイス国立科学財団助成金番号31003A_146475 / 1に、Siによって賄われていましたnergiaスイス国立科学財団助成金番号CRSII3-154405、財団ロマンドはラRECHERCHEシュールDiabète、ボーHjelt財団、財団エルンストらルーシーシュミットハイニー、およびソシエテAcadémiqueドゥジュネーブ（CDを）注ぎます。
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
References
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