قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية
Summary
Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.
Abstract
الساعات الإيقاعية وظيفية في جميع الكائنات الحساسة للضوء، مما يسمح للتكيف مع العالم الخارجي عن طريق توقع التغيرات البيئية اليومية. وقد تم إحراز تقدم كبير في فهمنا للعلاقة الوثيقة بين الساعة الإيقاعية ومعظم جوانب علم وظائف الأعضاء في المجال على مدى العقد الماضي. ومع ذلك، كشف الأساس الجزيئي الذي يكمن وراء وظيفة مذبذب الساعة البيولوجية في الإنسان يبقى من أعلى تحديا تقنيا. هنا، ونحن نقدم وصفا مفصلا لنهج تجريبي لفترة طويلة الأجل (2-5 أيام) تسجيل تلألؤ بيولوجي وجمع تدفق المتوسطة في الخلايا الأولية البشرية المستزرعة. لهذا الغرض، قمنا transduced الخلايا الأولية مع مراسل وسيفيراز lentiviral التي هي تحت سيطرة أحد المروجين الجين الساعة الرئيسية، والذي يسمح لتقييم مواز من إفراز هرمون وتلألؤ بيولوجي الإيقاعية. وعلاوة على ذلك، نحن تصف الظروف لتعطيل الساعة اليومية في العلاقات العامةالخلايا البشرية imary التي transfecting سيرنا استهداف مدار الساعة. نتائجنا على تنظيم الساعة البيولوجية من إفراز الأنسولين من البنكرياس الجزر الإنسان، وإفراز myokine من قبل خلايا العضلات والهيكل العظمي الإنسان، وهي معروضة هنا لتوضيح تطبيق هذه المنهجية. ويمكن استخدام هذه الإعدادات لدراسة التركيب الجزيئي للساعات الطرفية البشرية وتحليل تأثيرها وظيفية في الخلايا الأولية في ظل الظروف الفسيولوجية أو المرضية.
Introduction
برز نظام توقيت الساعة البيولوجية (من اللاتينية "حوالي عام اليومية") في جميع الكائنات الحساسة للضوء، وآلية التكيف مع دوران الأرض. في الثدييات، ويتم تنظيم ذلك بطريقة هرمية، ويشمل على مدار الساعة المركزية، والتي تقع في النواة التأقلم من منطقة ما تحت المهاد بطني، والطرفية (أو الرقيق) مؤشرات التذبذب التي هي عميلة في الأجهزة المختلفة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه الخلايا ذاتية الحكم مؤشرات التذبذب مكتفية ذاتيا وظيفية تقريبا في كل خلية من خلايا الجسم 1. تمثل إشارات ضوئي جديلة مزامنة المهيمنة (Zeitgeber) لالخلايا العصبية SCN، في حين أن الإشارات العصبية والخلطية المنبثقة عن اللجنة الدائمة للتغذية إعادة تعيين الساعات الطرفية. وبالإضافة إلى ذلك ايقاعات بقية النشاط، التي تدفع في دورات التغذية الصيام بدوره، هي المزيد من المزامنات لساعات الطرفية 2. وفقا لفهمنا الحالي، يستند ماكياج الجزيئي للساعة رئيسية على النسخي وtranslaالحلقات ردود الفعل tional، والتي يتم حفظها بين الكائنات الحية. هذا يضم منشطات النسخ BMAL1 وعلى مدار الساعة، التي تنشط معا النسخ للجينات الساعة الأساسية لكل وCRY السلبية. ومستويات عالية من PER والبروتينات CRY تمنع النسخ الخاصة بهم من خلال تثبيط مجمع / ساعة BMAL1. وتتكون حلقة المساعدة من المستقبلات النووية REV-ERBs وRORs، التي تنظم أيضا نسخ من BMAL1 وعلى مدار الساعة. وعلاوة على ذلك، والأحداث posttranslational بما في ذلك الفسفرة، sumoylation، أستلة، O-GlcNAcylation والتدهور والدخول النووي من البروتينات على مدار الساعة الأساسية تمثل طبقة تنظيمية هامة إضافية في إنشاء 24 ساعة التذبذب دورة 3.
ينبع الأدلة التراكمية من الدراسات التي أجريت في نماذج القوارض ويسلط الضوء على الدور الحاسم للنظام الساعة البيولوجية في تنسيق التمثيل الغذائي والغدد الصماء وظائف 4-5. وهناك عدد من تأالبريد نطاق التحليل Transcriptome على تشير إلى أن التغذية – الصيام دورات تلعب دورا مركزيا في تزامن مؤشرات التذبذب الطرفية 6-8. في اتفاق مع هذه الدراسات، وقد كشف تحليل metabolomic وlipidomic في القوارض والبشر أن عددا كبيرا من المركبات تتذبذب في الأنسجة، والبلازما، واللعاب بطريقة الإيقاعية 9-11. الأهم من ذلك، معظم الهرمونات يحمل إيقاعات الساعة البيولوجية في 5،12-13 الدم. وعلاوة على ذلك، والساعات الإيقاعية من هرمون المقابلة إنتاج الأنسجة الطرفية قد ينظم إفراز هرمون محليا. وقد وصفت مؤشرات التذبذب الإيقاعية خلايا مستقلة في القوارض والخلايا خلايا البنكرياس البنكرياس الإنسان 14-16. هذه المؤشرات تلعب دورا أساسيا في تنظيم Transcriptome على جزيرة البنكرياس وظيفة 15،17-18. وعلاوة على ذلك، فقد ثبت myokine إفراز بواسطة myotubes الهيكل العظمي البشري مؤخرا لعرض نمط الإيقاع اليومي، الذي ينظمه oscillato خلايا مستقلةالتمرير المنطوق في هذه الخلايا 19.
وقد استخدمت عدة طرق لدراسة ايقاعات كل يوم في البشر في الجسم الحي على نطاق واسع. على سبيل المثال، تم دراستها الميلاتونين البلازما أو مستويات الكورتيزول وكذلك الصدرية درجة حرارة سطح الجلد (إعادة النظر في المراجع 3،20) لتقييم الساعات الساعة البيولوجية الداخلية. على الرغم من أن هذه الأساليب تسمح دراسة التذبذبات الإيقاعية النظامية في الجسم الحي، فهي بعيدة كل البعد عن توفير تقييم دقيق لإيقاعات الساعة البيولوجية مستقلة خالية من يعمل في الأجهزة والأنسجة المختلفة. ومع ذلك، فإن مثل هذا التشريح من التنظيم المنهجي أن يكون أداة لا غنى عنها لفهم تأثير معين من الساعات الجزيئية الخلايا على وظيفة هذه الخلايا. ولذلك، فقد بذلت جهدا كبيرا لوضع نهج يمكن الاعتماد عليها لدراسة الساعات الإنسان في الخلايا المستزرعة مخلد أو الأولية متزامنة في المختبر. الأهم من ذلك، وقد ثبت أنخصائص ساعة قياس في الخلايا الأولية الليفية الجلد مثقف تعكس بشكل وثيق خصائص مدار الساعة الفردية الكائن الحي كله 21. تطوير صحفيين الساعة البيولوجية الفلورسنت وإضاءة الحيوية التي تقدمت كثيرا هذا النهج 22-27. وعلاوة على ذلك، ودراسة الساعات الخلية الأولية التي هي مستمدة من الأجهزة الطرفية المختلفة تتيح للتحقيق في الخصائص الجزيئية من الساعات الأنسجة محددة الإنسان 3،5،16،19-20،28. وهكذا، وتقييم الساعات الساعة البيولوجية في المختبر في إإكسبلنتس أو الخلايا الأولية متزامنة، وذلك باستخدام صحفيين إضاءة الحيوية، يمثل طريقة مفيدة للغاية لدراسة التركيب الجزيئي للساعات الطرفية البشرية وتأثيرها على وظيفة الجهاز.
في هذه المقالة، وسوف نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لتقييم التعبير الجيني الساعة البيولوجية في جزيرة الابتدائية والعضلات والهيكل العظمي خلايا الإنسان متزامنة في المختبر، وكذلك تأثير على مدار الساعة الخلوية مستقلةاضطراب في وظيفة إفرازية من هذه الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتتكون الإعدادات التجريبية الموصوفة هنا التسليم lentiviral من الصحفيين تلألؤ بيولوجي الساعة البيولوجية في الخلايا الأولية البشرية المستزرعة، تليها مزامنة لاحقة في المختبر والتسجيل المتواصل من تلألؤ بيولوجي لعدة أيام، وتحليل مواز من إفراز هرمون من قبل نفس الخلايا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لزملائنا من جامعة جنيف: جاك فيليب لتعليقات بناءة على هذا العمل، Ueli Schibler للمساعدة لا تقدر بثمن مع تطوير نظام perifusion وللإلهام العلمي، أندريه Liani لديها تصور التصميم والتصنيع والتكليف نظام الارواء، لسة-التكنولوجيا المحدودة شركة للمساعدة في نظام perifusion وتطوير البرمجيات بالتنقيط biolumicorder، جورج Severi للحصول على المساعدة مع التجارب perifusion، أورسولا Loizides-مانغولد لقراءة نقدية للمخطوطة، وآن ماري مخلوف للتحضير الفيروسة البطيئة . لاتيان Lefai، ستيفاني Chanon وهوبير فيدال (INSERM، ليون) لإعداد myoblasts الأولية الإنسان؛ ودومينيكو بوسكو والفرنسي تييري Berney (مركز زرع جزيرة الإنسان، مستشفى جامعة جنيف) لتوفير الجزر الإنسان. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل رقم الوطني السويسري منحة مؤسسة العلوم 31003A_146475 / 1، وسيnergia العلوم الوطنية السويسرية مؤسسة منحة رقم CRSII3-154405، مؤسسة الروماندية صب لا بحوث سور Diabète، مؤسسة بو Hjelt، مؤسسة إرنست وآخرون لوسي شميدهيني، وسوسيتيه Académique دو جنيف (CD).
Materials
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 25300-054 | For muscle biopsy digestion |
| DPBS no calcium no magnesium | Invitrogen | 14190-094 | |
| HAM F-10 | Invitrogen | 41550-021 | For myoblasts culture |
| FBS | Invitrogen | 10270 | Supplement to culture medium |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P0781-100 | Supplement to culture medium |
| Gentamycin | Axon | A1492.0001 | Supplement to culture medium |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-026 | Amphotericin B, supplement to culture medium |
| DMEM 1g/L glucose + Na pyruvate + glutamax | Invitrogen | 21885-025 | For myotubes culture |
| DMEM 1g/L glucose -Na Pyruvate – glutamax | Invitrogen | 11880-028 | Recording medium for LumiCycle |
| Glutamax | Invitrogen | 35050-028 | L-alanyl-L-glutamine dipeptide, supplement to recording medium |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | Cell detachment solution, for islet cell dissociation |
| CMRL | Gibco | 21530-027 | Culture medium for islet cells |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360-039 | Supplement to culture medium |
| 15 ml High-Clarity Polipropylene Conical Tube | Falcon | 352096 | |
| F75 flask | BD Falcon | 353136 | |
| 3.5 cm Petri dish | BD Falcon | 353001 | |
| Foskolin | Sigma | F6886 | Adenylyl cyclase activator, used for synchronization |
| Luciferin | Prolume LTD | 260150 | Supplement to recording medium |
| OptiMEM | Invitrogen | 51985-026 | Serum-free Minimal Essential Medium (MEM) used for human islet cells transfection |
| Lipofectamine RNAiMAX reagent | Invitrogen | 13778-150 | Transfection reagent |
| HiPerFect reagent | Qiagen | 301705 | Transfection reagent |
| ON-TARGET plus siCLOCK smartpool | Dharmacon | L-008212-00 | |
| ON-TARGET plus non targeting siRNA #1 (siControl) | Dharmacon | D-001810-01 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For myotubes DNA extraction |
| RNeasy Plus Mini kit | Qiagen | 74104 | For myotubes RNA extraction |
| QIAshredder | Qiagen | 79654 | For myotubes RNA extraction |
| 2 ml collecting tubes | Axygen | 311-10-051 | To collect the medium with the perifusion |
| Tissue culture Plate, 6 Well | BD Falcon | 353046 | To collect the medium with the perifusion |
| RNeasy Plus Micro kit | Qiagen | 74034 | For islet RNA extraction |
| Human IL-6 Instant ELISA kit | eBioscience | 88-7066-22 | |
| Human Insulin Kit Mercodia | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Hydrochloric acid, min,37%,p.a. | Acros organics | 124630010 | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Ethanol (>99.8%) | Fluka Analytical | 02860-1L | Used for preparation of lysis buffer (375ml Ethanol+7.5%HCl+117.5%H2O) |
| Human Islets for Research | Prodo Laboratories | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment: | |||
| Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R | |
| Water bath | VWR | 1112A | at 37 °C |
| Tissu culture hood | Faster | SafeFastElite | |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Heraeus | HeraCell 150 | 5% CO2 at 37 °C, no water due to the LumiCycle installation |
| Tissu culture incubator | Thermo Scientific | Hera Cell 150i | 5% CO2 at 37 °C |
| Shaker | Heidolph Instruments | Unimax 1010 | For agitation of the siRNA mix |
| LumiCycle | Actimetrics | ||
| LumiCycle software | Actimetrics | ||
| CosinorJ software | EPFL | Freely available at: http://bigwww.epfl.ch/algorithms/cosinorj/ | |
| Rheodyne titan MX | ERC GmbH | Control software that controls the timing of the automated switch | |
References
- Albrecht, U. Timing to perfection: the biology of central and peripheral circadian clocks. Neuron. 74 (2), 246-260 (2012).
- Dibner, C., Schibler, U., Albrecht, U. The mammalian circadian timing system: organization and coordination of central and peripheral clocks. Annu Rev Physiol. 72, 517-549 (2010).
- Dibner, C., Schibler, U. Circadian timing of metabolism in animal models and humans. J Intern Med. , (2015).
- Marcheva, B., et al. Circadian clocks and metabolism. Handb Exp Pharmacol. (217), 127-155 (2013).
- Philippe, J., Dibner, C. Thyroid circadian timing: roles in physiology and thyroid malignancies. J Biol Rhythms. 30 (2), 76-83 (2015).
- Andrews, J. L., et al. CLOCK and BMAL1 regulate MyoD and are necessary for maintenance of skeletal muscle phenotype and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 19090-19095 (2010).
- McCarthy, J. J., et al. Identification of the circadian transcriptome in adult mouse skeletal muscle. Physiol Genomics. 31 (1), 86-95 (2007).
- Shostak, A., Husse, J., Oster, H. Circadian regulation of adipose function. Adipocyte. 2 (4), 201-206 (2013).
- Dallmann, R., Viola, A. U., Tarokh, L., Cajochen, C., Brown, S. A. The human circadian metabolome. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2625-2629 (2012).
- Adamovich, Y., et al. Circadian clocks and feeding time regulate the oscillations and levels of hepatic triglycerides. Cell Metab. 19 (2), 319-330 (2014).
- Chua, E. C., et al. Extensive diversity in circadian regulation of plasma lipids and evidence for different circadian metabolic phenotypes in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (35), 14468-14473 (2013).
- Kalsbeek, A., Fliers, E. Daily regulation of hormone profiles. Handb Exp Pharmacol. (217), 185-226 (2013).
- Hastings, M., O’Neill, J. S., Maywood, E. S. Circadian clocks: regulators of endocrine and metabolic rhythms. J Endocrinol. 195 (2), 187-198 (2007).
- Muhlbauer, E., Wolgast, S., Finckh, U., Peschke, D., Peschke, E. Indication of circadian oscillations in the rat pancreas. FEBS Lett. 564 (1-2), 91-96 (2004).
- Marcheva, B., et al. Disruption of the clock components CLOCK and BMAL1 leads to hypoinsulinaemia and diabetes. Nature. 466 (7306), 627-631 (2010).
- Pulimeno, P., et al. Autonomous and self-sustained circadian oscillators displayed in human islet cells. Diabetologia. 56 (3), 497-507 (2013).
- Perelis, M., et al. Pancreatic beta cell enhancers regulate rhythmic transcription of genes controlling insulin secretion. Science. 350 (6261), (2015).
- Saini, C., et al. A functional circadian clock is required for proper insulin secretion by human pancreatic islet cells. Diabetes Obes Metab. , (2015).
- Perrin, L., et al. Human skeletal myotubes display a cell-autonomous circadian clock implicated in basal myokine secretion. Mol Metab. 4 (11), 834-845 (2015).
- Saini, C., Brown, S. A., Dibner, C. Human peripheral clocks: applications for studying circadian phenotypes in physiology and pathophysiology. Front Neurol. 6, 95 (2015).
- Brown, S. A., et al. Molecular insights into human daily behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (5), 1602-1607 (2008).
- Asher, G., et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation. Cell. 134 (2), 317-328 (2008).
- Dibner, C. On the robustness of mammalian circadian oscillators. Cell Cycle. 8 (5), 681-682 (2009).
- Dibner, C., et al. Circadian gene expression is resilient to large fluctuations in overall transcription rates. EMBO J. 28 (2), 123-134 (2009).
- Nagoshi, E., et al. Circadian gene expression in individual fibroblasts: cell-autonomous and self-sustained oscillators pass time to daughter cells. Cell. 119 (5), 693-705 (2004).
- Sage, D., Unser, M., Salmon, P., Dibner, C. A software solution for recording circadian oscillator features in time-lapse live cell microscopy. Cell Div. 5, (2010).
- Kowalska, E., Moriggi, E., Bauer, C., Dibner, C., Brown, S. A. The circadian clock starts ticking at a developmentally early stage. J Biol Rhythms. 25 (6), 442-449 (2010).
- Mannic, T., et al. Circadian clock characteristics are altered in human thyroid malignant nodules. J Clin Endocrinol Metab. 98 (11), 4446-4456 (2013).
- Parnaud, G., et al. Proliferation of sorted human and rat beta cells. Diabetologia. 51 (1), 91-100 (2008).
- Agley, C. C., Rowlerson, A. M., Velloso, C. P., Lazarus, N. L., Harridge, S. D. Isolation and quantitative immunocytochemical characterization of primary myogenic cells and fibroblasts from human skeletal muscle. J Vis Exp. (95), e52049 (2015).
- Liu, A. C., et al. Redundant function of REV-ERBalpha and beta and non-essential role for Bmal1 cycling in transcriptional regulation of intracellular circadian rhythms. PLoS Genet. 4 (2), e1000023 (2008).
- Hughes, M. E., Hogenesch, J. B., Kornacker, K. JTK_CYCLE: an efficient nonparametric algorithm for detecting rhythmic components in genome-scale data sets. J Biol Rhythms. 25 (5), 372-380 (2010).
- Dyar, K. A., et al. Muscle insulin sensitivity and glucose metabolism are controlled by the intrinsic muscle clock. Mol Metab. 3 (1), 29-41 (2014).
- Innominato, P. F., et al. The circadian timing system in clinical oncology. Ann Med. 46 (4), 191-207 (2014).
- Chitikova, Z., et al. Identification of new biomarkers for human papillary thyroid carcinoma employing NanoString analysis. Oncotarget. 6 (13), 10978-10993 (2015).
- Pagani, L., et al. The physiological period length of the human circadian clock in vivo is directly proportional to period in human fibroblasts. PLoS One. 5 (10), e13376 (2010).
