Методы для изучения липидных изменений в нейтрофилах и последующее образование нейтрофильных внеклеточных ловушек

Липиды было показано, играют важную роль в гомеостазе клетки, клеточной гибели, хозяин-патоген взаимодействия и высвобождение цитокинов ^1. Со временем интерес к и знание о влиянии липидов в хост-патоген взаимодействий или воспаления увеличились, и несколько публикаций подтверждают центральную роль некоторых липидов, особенно холестерина стероид, в клеточных реакций. Фармакологическое лечение статинов, которые используются в качестве ингибиторов биосинтеза холестерина, блокируя 3-гидрокси-3-метилглутарил-кофермент-A-редуктазу (ГМГ-КоА-редуктаза), может выступать в качестве противовоспалительных агентов пути снижения уровней в сыворотке крови интерлейкина 6 и С-реактивный белок ^2. Холестерином и гликосфинголипид обогащенные структуры могут быть использованы несколькими патогенами, такими как бактерии и вирусы, в качестве шлюза в хост ^{3, 4, 5,}класс = "внешние ссылки"> 6. Сфинголипиды (например, сфингомиелина), была показана для использования патогенов в целях содействия их патогенности ^7. В макрофагах, использование микобактерии холестерин обогащенных доменов для ввода клеток; истощение холестерина ингибирует поглощение микобактерий ^8. Кроме того, инфекция макрофагов с Francisella tularensis, зоонозного агента , ответственного за туляремии (также известный как лихорадка кролика) ^9, привело к инфекции , которая была отменена , когда уровень холестерина был исчерпан из мембран ^10. Аналогичным образом , вторжение в клетки – хозяина с помощью кишечной палочки богатых липидами структур было показано, что холестерин-зависимые ^4. Кроме того, Salmonella Typhimurium инфекции опыты эпителиальных клеток показали , что холестерин необходим для вступления патогенных микроорганизмов в клетки ^11. Холестерин истощение inhibiteд поглощение Salmonella ^11. Кроме того, недавнее исследование Gilk и соавт. показали , что холестерин играет важную роль в поглощении Coxiella burnetti ^12. Кроме того, Туонг и др. Обнаружено , что 25-hydroxycholesterol играет решающую роль в фагоцитозе липополисахарида (LPS) -стимулированных макрофаги ^13. Фагоцитоз был уменьшен , когда макрофаги обрабатывали фармакологически истощать холестерин ^14. Таким образом, холестерин и другие липиды , кажется, играют важную роль в инфекции и воспалении, так как их истощение может уменьшить риск вторжения от нескольких патогенов , ^{10, 11, 12.}

В последнее время мы смогли показать, что липидные изменения, особенно истощением холестерина из клетки, индуцирует образование нейтрофилов extracellulaг ловушка (сетки) в крови человек , полученные нейтрофилах ^15. С момента открытия НЭО в 2004 году, они были показаны , чтобы играть решающую роль в бактериальной провокации, и , таким образом , в препятствует распространению инфекции ^{16, 17.} НРТ состоят из основной цепи ДНК , связанной с гистонов, протеазы и антимикробных пептидов ^16. Выпуск Сетки нейтрофилами могут быть вызваны вторжения патогенных микроорганизмов ^{18, 19} и химические вещества , такие как форбол-миристат-ацетата (РМА) или статины ^{16, 20.} Однако подробные клеточные механизмы, и особенно роль липидов в этом процессе, все еще не совсем понятно. Анализ липидов может привести к лучшему пониманию механизмов, участвующих в самых разнообразных клеточных процессов и взаимодействий, таких как освобождение сетками. Cholesteрол и сфингомиелином являются жизненно важными компонентами клеточных мембран и липидных микродоменов, где они добавляют стабильности и облегчают кластеризацию белков , вовлеченных в незаконный оборот белка и события ²¹ сигнализации. Для того, чтобы исследовать механистическую роль определенных липидов, амфифильных фармакологических агентов, такие как циклический олигосахаридов метил-бета-циклодекстрин (MβCD), может быть использовано для изменения липидного состава клетки и уменьшить содержание холестерина в пробирке ^15. Здесь мы представляем метод использовать ВЭТСЙ для анализа липидного состава нейтрофилов в ответ на MβCD. ВЭЖХИ использовали для подтверждения уровня холестерина в популяции нейтрофилов. Кроме того, мы опишем метод, чтобы визуализировать образование сеток с помощью иммунофлуоресценции микроскопии в крови человека, полученных нейтрофилов в ответ на MβCD.