Méthodes d'étude Les modifications lipidiques de neutrophiles et de la formation subséquente des neutrophiles pièges extracellulaires

Lipids ont été montré à jouer un rôle important dans l' homéostasie cellulaire, la mort cellulaire, les interactions hôte-pathogène et la libération de cytokines ^1. Au fil du temps, l'intérêt et les connaissances sur l'impact des lipides dans les interactions hôte-pathogène ou l'inflammation ont augmenté, et plusieurs publications confirment le rôle central de certains lipides, en particulier le cholestérol des stéroïdes, dans les réponses cellulaires. Le traitement pharmacologique avec des statines, qui sont utilisés comme inhibiteurs de la biosynthèse du cholestérol en bloquant 3-hydroxy-3-méthylglutaryl-coenzyme-A-réductase (HMG-CoA-réductase), peut agir comme agents anti-inflammatoires en abaissant les taux sériques d'interleukine 6 et de la protéine C-réactive ^2. Cholesterol et de structures enrichi glycosphingolipides peuvent être utilisés par plusieurs agents pathogènes tels que des bactéries et des virus, comme une passerelle vers l'hôte ^{3, 4, 5,}class = "xref"> 6. Sphingolipides (par exemple, sphingomyéline) ont été montrées à utiliser par des agents pathogènes pour favoriser leur pathogénicité ^7. Dans les macrophages, l'utilisation des mycobactéries domaines enrichi en cholestérol pour pénétrer dans les cellules; une diminution du cholestérol inhibe l' absorption de mycobactéries ^8. En outre, l' infection des macrophages avec Francisella tularensis, un agent zoonotique responsable de la tularémie (également connu sous le nom de fièvre de lapin) ^9, a conduit à une infection qui a été aboli lorsque le cholestérol a été appauvri des membranes ^10. De même, l'invasion de cellules hôtes de Escherichia coli par l' intermédiaire de structures riches en lipides a été démontrée comme dépendante de cholestérol ^4. De plus, Salmonella expériences d'infection typhimurium des cellules épithéliales ont montré que le cholestérol est essentiel pour l' entrée des agents pathogènes dans les cellules ^11. épuisement du cholestérol inhibited l'absorption de Salmonella ^11. De plus, une étude récente de Gilk et al. a démontré que le cholestérol joue un rôle important dans l'adoption de Coxiella burnetii ^12. De plus, Tuong et al. a révélé que 25 hydroxycholestérol joue un rôle crucial dans la phagocytose par lipopolysaccharide (LPS) ¹³ macrophages stimulées. Phagocytose a été réduite lorsque les macrophages ont été traités sur le plan pharmacologique pour appauvrir le cholestérol ^14. , Semblent cholestérol et d' autres lipides ainsi jouer un rôle important dans l' infection et l' inflammation, car leur épuisement peut réduire le risque d'invasion de plusieurs agents pathogènes ^{10, 11, 12.}

Récemment, nous avons pu montrer que les altérations lipidiques, en particulier l'épuisement du cholestérol de la cellule, induire la formation de neutrophile milieu extracellulairepièges r (TNE) dans les neutrophiles du sang d'origine humaine ^15. Depuis la découverte de TNE en 2004, ils ont démontré qu'ils jouent un rôle essentiel dans le piégeage des bactéries, et donc à entraver la propagation de l' infection ^{16, 17.} TNE sont constitués d'un squelette d'ADN associée à des histones, des protéases, et des peptides antimicrobiens ^16. La libération des EVF par des neutrophiles peut être induite par des agents pathogènes envahissant ^{18, 19} et des substances chimiques telles que le phorbol-myristate-acétate (PMA) ou les statines ^{16, 20.} Cependant, les mécanismes cellulaires détaillés, et en particulier le rôle des lipides dans ce processus, ne sont pas encore tout à fait clair. L'analyse des lipides peut conduire à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans une grande variété de processus cellulaires et les interactions, telles que la libération de TNE. CholesteROL et sphingomyéline sont des constituants essentiels des membranes cellulaires et des lipides, microdomaines où ils ajoutent la stabilité et facilitent le regroupement des protéines impliquées dans le trafic des protéines et des événements de signalisation ^21. Pour étudier le rôle mécanique de certains lipides amphiphiles, des agents pharmacologiques, tels que la méthyl-β-cyclodextrine oligosaccharide cyclique (MβCD), peut être utilisé pour modifier la composition lipidique d'une cellule et pour réduire le cholestérol in vitro ^15. Nous présentons ici une méthode pour utiliser HPTLC pour analyser la composition lipidique des neutrophiles en réponse à MβCD. HPLC a été utilisé pour confirmer le taux de cholestérol dans la population neutrophile. De plus, nous décrivons une méthode pour visualiser la formation de TNE par microscopie immunofluorescence dans les neutrophiles dérivés du sang humain en réponse à MβCD.