ליפידים ידועים לשחק תפקיד חשוב פונקציות הסלולר. כאן, אנו מתארים שיטה כדי לקבוע את הרכב השומנים של נויטרופילים, עם דגש על רמת הכולסטרול, על ידי שימוש בשני HPTLC ו HPLC כדי להשיג הבנה טובה יותר של המנגנונים של היווצרות מלכודת תאי נויטרופילים.
ניתוח ליפידים בביצוע כרומטוגרפיה בשכבה דקה ביצועים גבוהים (HPTLC) הוא שיטה פשוטה יחסית, חסכונית לנתח מגוון רחב של שומנים. הפונקציה של ליפידים (למשל, באינטראקציות מארח הפתוגן או כניסה מארחת) דווחה לשחק תפקיד מכריע בתהליכים תאיים. הנה, אנחנו מראים שיטה לקביעת רכב שומנים, עם דגש על רמת הכולסטרול של נויטרופילים בדם נגזרות עיקריים, על ידי HPTLC בהשוואת כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (HPLC). המטרה הייתה לבדוק את תפקידו של שינויי שומנים / כולסטרול היווצרות מלכודות תאי נויטרופילים (נטס). שחרור NET ידוע כמנגנון הגנה מארחת כדי למנוע פתוגנים מלהתפשט בתוך הפונדקאי. לכן, נויטרופילים אדם נגזר דם טופלו מהתיל-β-cyclodextrin (MβCD) כדי לגרום שינויי שומנים בתאים. שימוש HPTLC ו HPLC, אנחנו הראינו שטיפול MβCD של תאי מוביל שומניםשינויים קשורים לירידה משמעותית תוכן הכולסטרול של התא. במקביל, טיפול MβCD של נויטרופילים הוביל להיווצרות של הנטס, כפי שמוצג על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence. לסיכום, כאן אנו מציגים שיטה מפורטת ללמוד שינויי שומנים ב נויטרופילים ויצירת רשתות.
ליפידים הוכחו ממלאים תפקידים חשובים הומאוסטזיס תא, מוות של תאים, אינטראקציות מארח הפתוגן, ציטוקינים שחרור 1. במשך הזמן, עניין וידע על ההשפעה של שומנים אינטראקציות מארח הפתוגן או דלקת גדלו, וכמה פרסומים לאשר את התפקיד המרכזי של שומנים מסוימים, ובמיוחד כולסטרול סטרואידים, בתגובות הסלולר. טיפול תרופתי בסטטינים, אשר משמשים מעכבי ביוסינתזה כולסטרול על ידי חסימת 3-הידרוקסי-3-methylglutaryl-coenzym-A-רדוקטאז (HMG-CoA-reductase), יכול לשמש סוכני אנטי דלקתיות כמו על ידי הורדת רמות בסרום של אינטרלוקין 6 ו 2 חלבון תגובתי C-. ניתן להשתמש Cholesterol- ומבנים מועשר glycosphingolipid ידי כמה פתוגנים, כגון חיידקים ווירוסים, כשער אל המארח 3, 4, 5,class = "Xref"> 6. ספינגוליפיד (למשל, ספינגומיילין) הוכח להיות בשימוש על ידי פתוגנים לקדם פתוגניות שלהם 7. מקרופאגים, השימוש mycobacteria כולסטרול מועשר תחומים להזנת התאים; דלדול של כולסטרול מעכב ספיגת mycobacterial 8. יתר על כן, זיהום של מקרופאגים עם Francisella tularensis, סוכן zoonotic אחראי טולרמיה (הידוע גם בשם קדחת ארנב) 9, הוביל לזיהום כי בוטלה כאשר הכולסטרול הידלדלה מחמת ממברנות 10. באופן דומה, הפלישה של תאים לארח על ידי coli Escherichia באמצעות מבני שומנים עשירים הודגמה להיות כולסטרול תלוי 4. יתר על כן, ניסויי זיהום סלמונלה typhimurium של תאי האפיתל הוכיחו כי הכולסטרול הוא חיוני עבור כניסת הפתוגן לתוך התאים 11. כולסטרול דלדול inhibiteד הספיגה סלמונלה 11. יתר על כן, מחקר שנערך לאחרונה על ידי אל Gilk et. כולסטרול הוכיח כי ממלא תפקיד חשוב ב ספיגת Coxiella burnetti 12. בנוסף, Tuong ואח. נמצא כי-hydroxycholesterol 25 משחקת תפקיד מכריע phagocytosis ידי lipopolysaccharide (LPS) -stimulated מקרופאגים 13. Phagocytosis הופחתה כאשר מקרופאגים טופלו פרמקולוגית כדי לרוקן כולסטרול 14. לפיכך, כולסטרול ושומנים אחרים נראו לשחק תפקיד חשוב זיהום ודלקת, מאז הדלדול שלהם יכול להפחית את הסיכון של פלישה מכמה פתוגנים 10, 11, 12.
לאחרונה, הצלחנו להראות כי שינויי שומנים, ובעיקר הדלדול של כולסטרול מן התא, לגרום להיווצרות extracellula נויטרופיליםמלכודות r (נטס) ב נויטרופילים בדם הנגזרות אנושי 15. מאז גילוי נטס ב 2004, הם הוכחו תפקיד קריטי מלכוד חיידקי, ובכך להוות מכשול התפשטות הזיהום 16, 17. רשתות מורכבות של עמוד השדרה DNA הקשורים היסטונים, פרוטאזות, ופפטידים מיקרוביאלית 16. המהדורה של הנטס על ידי נויטרופילים יכול להיגרם על ידי הפולשים פתוגנים 18, 19 ו חומרים כימיים כגון phorbol-myristate-אצטט (PMA) או סטטינים 16, 20. עם זאת, המנגנונים הסלולר המפורטים, ובמיוחד התפקיד של שומנים בתהליך הזה, הם עדיין לא ברורים לחלוטין. הניתוח של שומנים יכול להוביל להבנה טובה יותר של המנגנונים העוסקים במגוון רחב של תהליכים תאיים ואינטראקציות, כגון שחרור נטס. Cholesteרול ו ספינגומיילין הם מרכיבים חיוניים של microdomains קרום התא השומנים, שם הם מוסיפים יציבות להקל על התקבצות של חלבונים המעורבים בסחר חלבון איתות אירועים 21. בכדי לחקור את תפקיד מכניסטית של שומנים מסוימים, סוכנים תרופתי amphiphilic, כגון מתיל-β-cyclodextrin oligosaccharide מחזורית (MβCD), שניתן להשתמש בהם כדי לשנות את הרכב השומנים של התא כדי להפחית כולסטרול במבחנה 15. כאן, אנו מציגים שיטה להשתמש HPTLC לנתח את הרכב השומנים של נויטרופילים בתגובה MβCD. HPLC שימש כדי לאשר את רמת הכולסטרול באוכלוסיה נויטרופילים. יתר על כן, אנו מתארים שיטה לחזות ההיווצרות של הנטס על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence ב נויטרופילים בדם נגזרות אנושיים בתגובת MβCD.
השיטות שתוארו כאן ניתן להשתמש כדי לנתח שומנים ספציפיים, כגון כולסטרול, על ידי HPTLC או HPLC ו לחקור את ההשפעות של שינויי שומנים תרופתיים על ההיווצרות של הנטס (ראה נוימן ואח '. 15).
HPTLC היא שיטה יחסית חסכונית ופשוטה לנת?…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענק של Akademie für Tiergesundheit (AFT) וכן מענק של התוכנית PhD, "Animal ו מידבקות מחיות לאדם דלקות," של האוניברסיטה לרפואה וטרינרית, הנובר, גרמניה, הניתן אריאן נוימן.
Neutrophil isolation, NET staining and quantification | |||
Alexa Flour 633 goat anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-21070 | |
Anti-MPOα antibody | Dako | A0398 | |
BSA | Sigma-Aldrich | 3912-100G | |
Marienfeld-Neubauer improved counting chamber | Celeromics | MF-0640010 | |
Confocal microscope TCS SP5 AOBS with tandem scanner | Leica | DMI6000CS | |
Dulbecco´s PBS 10X | Sigma-Aldrich | P5493-1L | Dilute 1:10 in water for 1X working solution |
Dy Light 488 conjugated highly cross-absorbed | Thermo Fisher Scientific | 35503 | |
Excel | Microsoft | 2010 | |
DNA/Histone 1 antibody | Millipore | MAB3864 | |
Image J | NIH | 1.8 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Light microscope | VWR | 630-1554 | |
Methyl-β-cyclodextrin | Sigma-Aldrich | C4555-1G | |
PFA | Carl Roth | 0335.3 | dissolve in water, heat up to 65 °C and add 1N NaOH to clear solution |
PMA | Sigma-Aldrich | P8139-1MG | Stock 16 µM, dissolved in 1X PBS |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
Polymorphprep | AXIS-SHIELD | AN1114683 | |
ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P7481 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent | Invitrogen | P7581 | |
RPMI1640 | PAA | E 15-848 | |
HBSS with CaCl and Mg | Sigma | H6648 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ml | |
Trypanblue | Invitrogen | 15250-061 | 0.4% solution |
Water | Carl Roth | 3255.1 | endotoxin-free |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Lipid isolation and analysis | |||
1-propanol | Sigma-Aldrich | 33538 | |
10 µl syringe | Hamilton | 701 NR 10 µl | |
Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 346136 | |
Ethyl acetate | Carl Roth | 7336.2 | |
Canullla 26G | Braun | 4657683 | |
Copper(II)sulphatepentahydrate | Merck | 1027805000 | |
Chloroform | Carl Roth | 7331.1 | |
CP ATLAS software | Lazarsoftware | 2.0 | |
Chromolith HighResolution RP-18 endcapped 100-4.6 mm column | Merck | 152022 | |
High Performance Liquid Chromatograph Chromaster | Hitachi | HITA 892-0080-30Y | Paramaters are dependent on individual HPLC machine |
HPLC UV Detector | Hitachi | 5410 | |
HPLC Column Oven | Hitachi | 5310 | |
HPLC Auto Sampler | Hitachi | 5260 | |
HPLC Pump | Hitachi | 5160 | |
Methanol | Carl Roth | 7342.1 | |
n-Hexane | Carl Roth | 7339.1 | |
Phosphoric acid | Sigma-Aldrich | 30417 | |
Potassium chloride | Merck | 49,361,000 | |
Potters | LAT Garbsen | 5 ml | |
SDS | Carl Roth | CN30.3 | |
HPTLC silica gel 60 | Merck | 105553 | |
Vacufuge plus basic device | Eppendorf | 22820001 | |
Corning Costar cell culture 48-well plate, flat bottom | Sigma | CLS3548 | |
Coverslip | Thermo Fisher Scientific | 1198882 | |
Glass slide | Carl Roth | 1879 | |
BD Tuberculin Syringe Only 1 ml | BD Bioscience | 309659 |