Definieren von Substratspezifität für Lipase und Phospholipase-Kandidaten

Glycerol-basierten Lipiden wie Triglyceriden und (glycero) Phospholipide sind wichtige und wohl die bekanntesten Lipidklassen ^1. Triacylglycerolen (TAGs) sind Fette oder Öle, die üblicherweise als Speicherlipiden funktionieren und daher als potentielle Energie und Kohlenstoffquellen. TAGs können durch Lipasen abgebaut werden, die häufig durch den produzierenden Organismus ausgeschieden werden externe TAGs zu verdauen und sie als Kohlenstoffquellen zur Verfügung zu stellen. Auch wurden Lipasen weit über die Jahre studiert aufgrund ihrer wichtigen biotechnologischen Anwendungen ^2.

Auf Grund ihrer amphiphilen Natur und ihrer nahezu zylindrischen Form, (glycero) Phospholipide weisen membranbildenden Eigenschaften und in der Regel die Hauptlipidkomponenten einer doppelschichtigen Membran ³ bilden. In einfachen Mikroorganismen wie dem Bakterium Escherichia coli, nur drei Hauptkopfgruppe Varianten, Phosphatidylglycerin (PG), Cardiolipin (CL) und phosphatidylethanolamine (PE) angetroffen werden , obwohl man sich bewusst sein sollte , dass jeder von ihnen kann ⁴ mit einer beträchtlichen Anzahl unterschiedlicher Fettacylketten an der sn – 1 oder sn – 2 – Position, die zu einer großen Anzahl von verschiedenen molekularen Spezies ersetzt werden . Andere Bakterien könnten haben andere Phospholipide zusätzlich oder statt. Zum Beispiel Sinorhizobium meliloti, ein Bodenbakterium, das mit der Leguminosen Luzerne (Medicago sativa) , um eine Stickstoff-fixierenden Knöllchen Symbiose zu bilden, enthält zusätzlich zu PE ein zweites zwitterionisches Phospholipid, Phosphatidylcholin (PC) ⁵ in der Lage ist. Auch Lipide nicht, die Phosphor oder Glycerin können amphiphile und bilden einen Teil der Zellmembran sein. Beispielsweise von Phosphor beschränkende Wachstumsbedingungen in S. meliloti, (glycero) Phospholipide sind weitgehend durch Membranlipide ersetzt , die nicht Phosphor enthalten, dh Sulfolipide, Ornithin Lipide und diacylglyceryl trimethylhomoserine (DGTS) ^6. In Bakterien ist DGTS von Diacylglycerin (DAG) in einem zweistufigen Weg gebildet ⁷ , aber die Quelle für DAG Generation war nicht klar. Pulse-Chase – Experimente vorgeschlagen , dass PC ein Vorläufer für ⁸ DGTS sein könnte und mit Hilfe der Methodik in diesem Manuskript beschrieben wir eine Phospholipase C identifizieren konnte (PLCP, SMc00171) , die unter Phosphor einschränkenden Bedingungen gebildet wird , und die PC in DAG umwandeln und Phosphocholin ^8.

In einer separaten Studie entdeckten wir , dass eine Acyl-CoA – Synthetase (FADD) defizienten Mutante von S. meliloti oder von Escherichia coli freien Fettsäuren akkumuliert , wenn ⁹ stationären Wachstumsphase eintritt. Obwohl diese Fettsäuren schienen von Membranlipiden abgeleitet werden, die genaue Quelle für die freien Fettsäuren oder die Enzym (e) zu befreien, sie waren nicht bekannt. Auch in diesem Manuskript die Strategie skizziert den Einsatz, zwei Patatin-like ¹⁰ (phospho) Lipasen (SMc00930 und SMc01003), die zur Bildung von freien Fettsäuren in S. beigetragen meliloti ¹¹ vorhergesagt wurden. Überraschenderweise verwendet SMc01003 DAG als Substrat Umwandlung in Monoacylglycerin und schließlich ¹¹ Glycerin und freien Fettsäuren. Daher ist SMc01003 eine DAG-Lipase (DGLA).

Obwohl eine Reihe von Algorithmen zur Vorhersage Potential (phospho) sind Lipasen ^12,13, deren genaue Funktion und physiologische Rolle ist in der Regel nicht bekannt. Hier beschreiben wir ein Protokoll, zu klonen und überexprimiert vorhergesagt oder Potential (phospho) Lipasen. Diese Handschrift wird erläutert, wie Enzymassays können unter Verwendung von künstlichen chromogene Substrate für die überexprimiert (phospho) Lipase entwickelt und optimiert werden. Wir liefern Beispiele, wie mit einem optimierten Enzymtest die reale (phospho) Lipasesubstrats begegnet werden kann und wie diese Erkenntnisse könnten unser Verständnis der mikrobiellen Physiologie bereichern.